腦小血管病患者血清SIRT1水平與腦白質病變及認知障礙的相關性分析

倪 怡 周 永 張冬梅 邢 燦 朱向陽

南通大學第二附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001

腦 小 血 管 病（cerebral small vessel disease，CSVD）是一組由各種病因導致的腦穿通小血管的病變，最終表現(xiàn)為具有特征性病理和影像學改變的臨床綜合征［1］。腦小血管病屬于隱襲性腦血管疾病之一，可致患者出現(xiàn)隱匿性腦卒中、認知功能障礙、癡呆及步態(tài)障礙等臨床疾病和癥狀［2］。近年來，CSVD作為引起認知障礙的重要病因，受到越來越多的關注，但其確切的發(fā)病機制目前尚不明確［3］。目前影像學檢查是CSVD 的主要診斷方法，其中頭顱MRI 對CSVD 的診斷靈敏且準確性最高。腦白質高信號（white matter hyperintensity，WMH）則是在T2加權磁共振成像（T2-FLAIR）上觀察到的大腦薄壁組織中的明亮區(qū)域，作為腦小血管疾病的一種典型影像學表現(xiàn)形式，這些區(qū)域主要反映了由脫髓鞘和軸突丟失引起的損傷［4-5］。WMH 被認為與認知測試中較差的表現(xiàn)有關［6-9］，與WMH 相關的潛在機制包括炎癥/氧化應激、缺血/低灌注、屏障/內皮功能障礙等病理改變，這些損傷可以最終導致患者神經網絡的紊亂，從而影響認知［10-13］。

沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種組蛋白去乙酰化酶，主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）。SIRT1最初被鑒定為細胞核蛋白，但隨后實驗表明，在神經元分化、腫瘤進展和凋亡期間，SIRT1也可穿梭至細胞質中［14］。SIRT1 廣泛表達于哺乳動物組織中，迄今已發(fā)現(xiàn)其在保護神經、調節(jié)DNA穩(wěn)定性、調控基因表達、維持染色體結構、控制細胞周期進程等方面都具有顯著影響［15］。既往報道SIRT1 水平與動脈粥樣硬化、糖尿病等密切相關［16］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 可改變腦組織氧化應激水平及炎癥程度，從而影響認知功能［17］。KHAN等［18］首次發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖誘導的小鼠神經炎癥模型中，激活SIRT1可以發(fā)揮神經保護作用。在傳統(tǒng)醫(yī)藥中，紫草提取物乙酰紫草素可通過上調海馬中的SIRT1表達，降低D-半乳糖相關的神經炎癥反應，起保護海馬作用［19］。除此之外，SIRT1 能調節(jié)自噬信號通路，在D-半乳糖所致的衰老中，尿蛋白A 通過上調SIRT1 信號通路和下調mTOR信號通路而激活自噬，延緩衰老所致認知功能障礙［20］。AMP-活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/SIRT1通路廣泛參與炎癥反應以及髓鞘脫失的過程，而炎癥反應以及髓鞘脫失與腦白質病變密切相關，就此本課題組提出假設，SIRT1水平與CSVD患者腦白質病變嚴重程度相關。

血清SIRT1水平與腦梗后認知障礙密切相關，但目前并沒有研究報道血清SIRT1 水平與CSVD 患者腦白質病變及認知功能之間的關聯(lián)。因此本課題組提出假設，即CSVD患者血清SIRT1水平與腦白質病變嚴重程度及認知障礙相關。本研究旨在評估CSVD 患者血清SIRT1 水平與腦白質病變分級及認知障礙是否存在相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2019-12—2021-05 南通大學第二附屬醫(yī)院神經內科收治的CSVD患者221例，其中5例患者臨床資料不全，3例患者無法配合完成頭顱MRI檢查，2例患者既往有腦卒中病史，1例患者有雙相情感障礙病史，1 例患者失語，最終209 例患者入組，男127例，女82例，年齡63～78歲。

納入標準：（1）符合CSVD 診斷標準；（2）發(fā)病前未診斷有認知或情感障礙病史；（3）在接受測驗時能配合神經心理學檢查，不需要言語和行為上的幫助；（4）患者知情并簽署知情同意書。排除標準：（1）除外腦部腫瘤等疾病；（2）排除既往有腦卒中病史；（3）其他非血管性因素致使患者認知功能減退的疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、額顳葉癡呆等；（4）患者處于抑郁狀態(tài)或存在影響認知評估的交流障礙因素，如語言、視覺、聽覺障礙等。

1.2 研究方法所有研究對象均接受詳細全面的身體檢查，包括常規(guī)實驗室檢查、神經心理學評估和頭顱MRI。

收集入組患者的年齡、性別、高血壓、糖尿病、心房顫動病史，以及吸煙和飲酒情況等資料。實驗室檢查包括糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C、尿酸、尿素、肌酐、纖維蛋白原、超敏C反應蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、紅細胞沉降率。上述所有血液樣本均于禁食12 h后獲得。靜脈抽取血液標本5 mL，分別置入抗凝管和無菌真空管內，4 ℃離心15 min，并采集血清和血漿，分裝后置于—20 ℃冰箱中貯存。

HbA1c、空腹血糖、TG、TC、LDL-c、HDL-c、尿酸、尿素、肌酐使用離子交換高效液相色譜法測定，酶催化法測定Hcy，選用定量毛細血管分光光度法檢測紅細胞沉降率。所有檢驗均在院內實驗室進行。

應用簡易智能狀態(tài)檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）、蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）評估患者認知功能。

1.3 頭顱MRI檢查及標記物評分 采用西門子公司3.0T MR 成像儀對患者進行頭顱MRI 檢查。采用Fazekas量表對室周WMH和深部WMH分別賦分，并計算室周和深部WMH賦分的總和作為總Fazekas評分，范圍0～6 分。WMH 的嚴重程度分類：輕度無癥狀WMH（Fazekas 量表評分0～2 分）和中重度WMH（Fazekas 量表評分3～6分）［21］。腔隙性梗死（lacunar infarction，LI）則是假定血管起源的，與T1WI 和T2WI序列上的腦脊液具有相似信號特征，具有直徑為3～15 mm的圓形或橢圓形病變，根據(jù)有無劃分［1］。腦微出血（cerebral microbleeds，CMBs）定義為SWI序列上直徑≤10 mm 的圓形病變［1］。血管周圍間隙擴大（enlarged perivascular spaces，EPVS）被定義為圓形、橢圓形或線性病變，直徑<3 mm，在穿孔小動脈的范圍之后，具有類似于腦脊液的信號，使用經過驗證的4 點定量量表（0 分=無，1 分=1～10 EPVS，2 分=11～20 EPVS，3 分=21～40 EPVS 和4 分>40 EPVS）評估半卵圓中心和基底神經節(jié)中心的EPVS。在這兩個水平上，本文對包含最多EPVS 的切片進行評分，并將中重度EPVS定義為評分≥2［22］。

影像學評估均由兩位具有豐富經驗的神經內科醫(yī)師評定，并與第三位評估者討論解決分歧。

1.4 SIRT1 含量測定研究對象的血液樣本在隔夜禁食后，于06：00～07：00收集。取空腹靜脈血5 mL，以3 500 r/min速度離心15 min，完成分裝置于—80 ℃冰箱保存。使用人類SIRT1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（中國Elabscience）仔細測量SIRT1濃度。根據(jù)8個水平的純化SIRT1（0，0.31，0.63，1.25，2.5，5，10，20 μg/L）繪制標準曲線。

1.5 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用SPSS 25.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件。呈正態(tài)分布的連續(xù)計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正太分布的連續(xù)計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，2 組比較采用χ2檢驗。采用二元logistic回歸對單變量分析中P<0.10的變量與CSVD患者影像學標記物進行分析，結果以比值比（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。為評估SIRT1 和各種CSVD影像學標記物之間關系的劑量依賴性，比較每種CSVD標記物（WMH、腔隙性梗死、CMBs和EPVS）不同負擔的個體之間的平均SIRT1 水平。應用Mann-WhitneyU檢驗，計算入組患者工作特征曲線（ROC）下面積，測量血清SIRT1 作為CSVD 患者WMH 損傷嚴重程度潛在標記物的效用。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入組患者的基線特征WMH的Fazekas評分中位數(shù)為3（1，4）。CSVD 患者的CMBs、腔隙性梗死和中重度EPVS 的發(fā)生率分別為66（31.58%）、167（79.90%）和131（62.68%）。血清SIRT1 的中位數(shù)為1.48（0.72，2.51）ng/L。見表1。

表1 入組患者基線資料Table 1 Baseline characteristics of the cohort

2.2 輕度無癥狀WMH與中重度WMH患者的基線特征中重度WMH 組患者的高脂血癥頻率較高，MMSE 評分、MoCA 評分及血清SIRT1 水平組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P=＜0.05，表2）。

表2 2組患者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline characteristics in the two groups

2.3 不同程度WMH可能的預測因子之間的回歸分析在進行多變量分析前，對單變量分析中P<0.10的變量進行多重共線性評估。結果顯示所有VIF 值均接近1，說明沒有多重共線性。在多變量Logistic模型分析中，以中重度WMH的存在或不存在為因變量，調整各種混雜因素后，發(fā)現(xiàn)血清SIRT1仍是WMH嚴重程度的獨立預測因子（OR=1.25，95%CI=1.034～1.512，P=0.021，表3）。

表3 可能的預測因子與腦小血管病中重度WMH之間的多變量回歸模型分析Table 3 Multivariable logistic regression analyses between possible predictors and moderate-severe WMH in CSVD

2.4 回歸分析分析可能的預測因子和腦微出血、腔隙性梗死和血管周圍間隙擴大在單變量和多變量分析中，血清SIRT1在CSVD患者其他表現(xiàn)的CMBs，腔隙性梗死和中重度EPVs 并不具有預測性。腔隙性梗死（OR=0.979，95%CI=0.817～1.173，P=0.819），CMBs（OR=0.996，95%CI=0.860～1.153，P=0.958）和中重度EPVs（OR=1.147，95%CI=0.956～1.377，P=0.141）。見表4、表5。

表4 可能的預測因子與腔隙性梗死、CMBs和EPVs 之間的單變量回歸模型分析Table 4 Univariable logistic regression analyses between possible predictors and lacunes, CMBs and EPVS

表5 可能的預測因子與腔隙性梗死、CMBs和EPVs之間的多變量回歸模型分析Table 5 Multivariable logistic regression analyses between possible predictors and lacunes, CMBs and EPVS

2.5 根據(jù)白質高信號嚴重程度、腦微出血、腔隙性梗死和血管周圍間隙擴大的SIRT1平均值分布評估血清SIRT1 水平與CSVD 不同有影像學表現(xiàn)之間的關系顯示，在室周和皮層下白質病變區(qū)域中，SIRT1水平與改良Fazekas 評分呈正劑量依賴性顯著相關，輕度無癥狀WMH組與中重度WMH組間SIRT1水平差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。EPVS 病變較重的CSVD 患者也表現(xiàn)出EPVS 負荷與SIRT 水平之間具有顯著相關性（P=0.024）。而CMB、腔隙性梗死則與SIRT1 水平無關（P=0.126，P=0.863，圖1）。CSVD 患者WMH 負荷（P＜0.001，r=0.262）和EPVS 病變數(shù)量（P=0.001，r=0.237）皆與SIRT1 水平呈正劑量依賴性顯著相關。

圖1 根據(jù)白質高信號嚴重程度、腦微出血、腔隙性梗死和血管周圍間隙擴大的SIRT1平均值分布Figure 1 Distribution of mean values according to the burdens of white matter hyperintensity, CMBs, lacunes, and EPVS

2.6 血清SIRT1 的ROC 曲線分析SIRT1 識別腦小血管病患者中重度WMH 的ROC 曲線AUC 0.627，敏感性為44.8%，特異性為79.8%，最佳臨界點為2.11 ng/L（P=0.002），見圖2。

圖2 SIRT1對于CSVD患者中重度WMH診斷中的ROC分析Figure 2 ROC analysis of SIRT1 in the diagnosis of moderate-severe WMH in

3 討論

本研究證實CSVD 患者血清SIRT1 水平和大腦白質損傷嚴重程度相關，即隨著CSVD患者腦白質病變的加重，患者血清SIRT1水平顯著升高。

SIRT1 作為第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙酰化酶家族成員，被認為是治療心腦血管疾病的潛在靶點。但SIRT1的保護作用仍存在爭議，因為并非所有的研究都發(fā)現(xiàn)了神經保護的證據(jù)［23］。SIRT1 在炎癥反應及髓鞘脫失的過程中發(fā)揮重要作用，以上過程與腦白質病變密切相關。在本次實驗中，白質病變較重的患者SIRT1水平顯著高于白質病變較輕患者，反映了SIRT1在其中起部分作用。

研究報道急性腦梗患者血清SIRT1 水平顯著高于健康對照組，但功能預后良好組患者的SIRT1水平并不顯著高于不良功能結果組患者［24］。這與既往研究中SIRT1的神經保護作用并不相符，但與本研究結果一致。

本研究表明CSVD 腦白質病變嚴重的患者血清SIRT1 水平顯著高于腦白質病變輕的患者，說明SIRT1作為組蛋白脫乙酰化酶中的一員，具有NAD+依賴的功能，并參與細胞多種代謝途徑［25］。說明SIRT1的活性主要依賴于細胞NAD+［26］。SIRT1的激活可導致NAD+消耗，降低聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）的活性，從而防止PARP-1 介導的細胞死亡［27］。然而，高濃度的SIRT1可能消耗過多甚至耗盡NAD+，這可能會增加紊亂，NAD+的減少可能反過來降低SIRT1活性。因此，這種影響進一步損傷了SIRT1的神經保護作用。有研究曾指出，在細胞具有足夠NAD+的條件下，SIRT1 可能促進細胞存活并參與適應性應激反應；相反，當NAD+水平有限時，刺激SIRT1活性可能使細胞容易死亡。這也解釋了在本研究CSVD 患者中，腦白質病變嚴重的患者血清SIRT1水平雖顯著高于腦白質病變較輕患者，但其認知評分顯著降低。但這仍需要進一步的研究來證明CSVD 患者中SIRT1和NAD+之間的關系。

作為CSVD 的典型影像學表現(xiàn)之一的WMH，又被稱為年齡相關性腦白質病變，考慮與缺氧低灌注、內皮細胞功能紊亂、炎癥反應等多因素相關［10］。因此本研究認為SIRT1 對其也起到一定保護作用。在疾病發(fā)展初期，患者血清SIRT1 水平上升，起到神經保護作用，與分子生物學水平的研究相一致［28］。考慮到隨著時間進展，患者病程延長，年齡增高，NAD+被耗盡，SIRT1水平的上升并未起到保護作用。這也與本研究中得到的結論，即腦小血管病患者腦白質損傷的嚴重程度與SIRT1 水平呈正相關一致。既往研究表明，WMH在癡呆或認知下降過程起重要作用［6］，這與本次研究結果相一致，即隨著患者腦白質損傷程度加重，患者的年齡逐漸上升，MMSE 和MoCA 評分逐漸下降，患者認知水平呈下降趨勢。

CSVD主要影像學標記物還包括LI、CMBs、EPVS等，對診斷CSVD具有重要意義［29］。本研究未觀察到LI、CMBs 與血清SIRT1 水平之間的相關性，這一結果可能歸因于納入參與者的特征。而患者Fazekas 評分和血清SIRT1水平具有顯著相關性。根據(jù)Fazekas 評分將患者分為輕度無癥狀WMH和中重度WMH，在不同WMH 分組的患者中，血清SIRT1水平具有顯著差異。因此，本研究證實SIRT1 水平對診斷腦小血管病患者腦白質損傷嚴重程度密切相關，且與認知功能的改變存在一定相關性。

由于只有部分CSVD 患者表現(xiàn)出中重度WMH，ROC 曲線分析被用來評估SIRT1 是否有潛力區(qū)分CSVD 中重度WMH 的患者。本研究ROC 曲線分析顯示，對于SIRT1，AUC 為0.627，靈 敏 度 為44.8%，特異度為79.8%（圖2）。表明SIRT1對CSVD的中重度WMH具有潛在的診斷價值。

本研究未設置健康對照組，基于以下考慮，因入組患者為＞60 歲老年人，而CSVD 發(fā)病具有隱匿性，并與年齡密切相關，因此既往無特殊病史的健康人有可能是潛在未確診的CSVD患者，所以本研究選擇在CSVD患者中進行分組探討。

本研究表明，腦小血管病患者血清SIRT1水平升高與CSVD患者白質病變嚴重程度相關，且與腦小血管病患者認知功能改變密切相關，其相關性在既往被認為腦小血管病患者較健康對照組患者降低的SIRT1 水平中以劑量依賴的方式被觀察到。本研究還存在一定局限性，本研究為單一中心、回顧性、針對單一種族人口的觀察性研究，由于橫斷面研究的局限性，并未對同一患者進行隨訪觀察，只能闡明其相關性，不能解釋SIRT1水平與腦白質損傷嚴重程度的因果關系。在后續(xù)研究中將進一步完善分組，擴大樣本量，進行前瞻性研究，從而深入完善研究內容，進行更詳細的數(shù)據(jù)分析處理，減少各項偏倚及誤差。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突