重組酶聚合酶擴增技術用于腦脊液中肺炎鏈球菌檢測的價值*

侯玉婷,俞夢楚,王妍柏,張 慶

寧夏醫科大學總醫院:1.神經內科腦脊液檢測室;2.醫學科學研究院;3.神經內科,寧夏銀川 750004

細菌性腦膜炎是由細菌直接侵入中樞神經系統(CNS)引起的嚴重感染性疾病,其發病率和病死率居高不下[1-2]。腦脊液(CSF)微生物培養是臨床診斷細菌性腦膜炎的常規方法之一,同時也是診斷的金標準,但由于細菌培養時間長,不能滿足臨床的早期診斷和指導臨床合理用藥需求。因此,快速、準確地檢測CSF中的致病菌是神經科醫生關注的重點,也是醫學檢驗需要面臨的問題。重組酶聚合酶擴增(RPA)是一種等溫基因核酸擴增技術,因其快速、特異、可靠等特點成為新的病原微生物分子診斷方法[3-5]。RPA可在恒溫條件下,20 min內進行DNA檢測,反應效率高。前期的研究發現,本院收治的肺炎鏈球菌性腦膜炎患者較多[6],因此本研究以肺炎鏈球菌為目的菌株。LepA蛋白是核糖體延伸因子,在原核生物中具有高度的序列保守性[7]。本研究以LepA基因作為鑒定肺炎鏈球菌的分子診斷靶點,利用RPA技術檢測CSF中肺炎鏈球菌,以CSF微生物培養的結果作為標準,探討RPA技術的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5月至2021年5月本院收治的確診及疑似細菌性腦膜炎患者52例為研究對象,其中男32例,女20例;年齡0.5～82.0歲。

1.2儀器與試劑 PCR儀(Analytikjena 德國)、Bio-Rad電泳儀(Bio-Rad 美國)、凝膠電泳儀(Azure美國)、Cytospin-4型細胞玻片離心儀(Thermo Scientific 美國)。瑞氏-姬姆薩染色液(珠海貝索生物技術有限公司)、TopRed核酸染料(北京博奧拓達科技有限公司)、DNA提取試劑盒(QIAamp DNA mini Kit 德國)、DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)、RPA反應試劑盒(TwistAmpTMBasic Kit 英國)。

1.3方法

1.3.1引物設計與合成 根據GenBank肺炎鏈球菌LepA基因(Genbank accession number NC_018594.1)的核酸序列及參考文獻[8]設計RPA引物,正向引物:ACAGCTCCGTCTGTTATTTACAAAGTTAATTTGA C;反向引物:AGTCCCCACGCTTACGCTGAGCT AGCTCCATTACT。擴增片段長度均為190 bp,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2CSF微生物培養 52例患者均進行常規CSF微生物培養,按照臨床檢驗操作規程對CSF標本進行微生物分離鑒定。

1.3.3CSF細胞學檢查和DNA提取 進行腰椎穿刺取CSF,采用血細胞計數板進行CSF中白細胞計數。吸取0.5 mL CSF置于標本室內,放置在細胞玻片離心儀內以113×g離心5 min制成CSF涂片。待涂片自然干燥后,滴加瑞氏-姬姆薩染色液,然后加入緩沖液并吹均勻,靜置5 min后流水沖洗。干燥后采用CSF細胞圖像診斷分析系統進行分類,計數100個細胞,計算單個核細胞(淋巴細胞、單核細胞)和多個核細胞(中性粒細胞)百分比[9]。剩余的CSF在室溫下12 000 r/min離心10 min,棄去上清液;按照試劑盒中說明書的操作方法提取CSF的DNA,檢測核酸濃度及純度后置于-20 ℃保存備用。

1.3.4CSF RPA檢測 將CSF標本的DNA按照TwistAmpTMBasic Kit試劑盒的說明書進行RPA檢測。反應體系如下:10 μmol/L的上、下游引物各2.4 μL,重組緩沖液29.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 12.2 μL,渦旋混勻后簡短離心。將上述47.5 μL的混合液移入預裝有凍干粉的反應管中并充分混勻,再加入280 mmol/L的醋酸鎂溶液2.5 μL,混勻后置于40 ℃恒溫儀中反應4 min。將反應管從恒溫儀中取出,上下翻轉混勻8～10次,簡短離心后再次置于40 ℃恒溫儀中反應16 min。

1.3.5RPA產物的結果判斷 按照DNA純化回收試劑盒的說明書將RPA反應產物進行純化,測定核酸濃度及純度后,通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.6RPA產物的驗證 根據瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果,選取部分陽性擴增產物送往上海生工生物工程有限公司進行測序,通過生物軟件VectorNTI分析臨床標本RPA產物的核酸序列與目標核酸序列的一致程度,驗證擴增產物是否為目的條帶。

1.4統計學處理 采用Excel 2007軟件進行數據分析。

2 結 果

2.1CSF微生物培養結果 CSF經微生物培養有19例(36.5%)為陽性。其中肺炎鏈球菌為7例;鮑曼不動桿菌5例;肺炎克雷伯菌2例;腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、單核細胞增生李斯特菌、緩癥鏈球菌和黏質沙雷菌分別為1例。CSF微生物培養陰性者為33例(63.5%)。

2.2CSF RPA檢測的結果 52例研究對象中,RPA陽性為14例(26.9%),陰性為38例(73.1%)。CSF標本的RPA產物電泳圖見圖1,陽性標本能擴增出清晰的RPA條帶,且條帶大小符合預期長度(190 bp)。

注:M為DNA分子質量標準;1～4為CSF標本(患者編號為1、3、4和6號)。

2.3RPA與微生物培養結果比較 微生物培養為陽性的19例(36.5%)患者中,有7例檢出肺炎鏈球菌,這7例的RPA檢測結果均為陽性。微生物培養為陰性的33例(63.5%)患者中,也有7例的RPA檢測結果為陽性。這7例患者藥物治療史和CSF細胞學檢查結果見表1。有12例患者CSF標本的培養結果為非肺炎鏈球菌,其RPA反應均為陰性。

表1 培養為陰性、RPA檢測為陽性患者的藥物治療史和細胞學檢查結果

2.4RPA產物的測序結果 CSF微生物培養和RPA檢測結果均為肺炎鏈球菌的7例患者,隨機選取3例(標本編號3、9、14)RPA產物進行測序。CSF微生物培養為陰性,RPA反應為陽性的7例患者的產物全部進行測序。共10份RPA的核酸產物與LepA基因的190 bp目標序列進行序列比對,結果見圖2。圖中黃色代表相同的序列;藍色代表相似的序列。測序時由于熒光染料的干擾,測序結果在引物3′端后面的10～30個堿基不一定能準確判讀。在第45個堿基位置(箭頭所示)以后RPA產物的核酸序列與目標序列一致,RPA擴增成功并獲得目的基因片段。

注:圖中黃色代表相同的序列;藍色代表相似的序列;箭頭為第45個堿基位置。

3 討 論

細菌性腦膜炎的病情進展快,嚴重威脅人們的生命健康,需要早期診斷并及時給予有效的治療。因此快速、準確的病原菌檢測是臨床確診細菌性腦膜炎的關鍵。在微生物分子檢測方法中,PCR技術為病原菌的診斷提供了依據,已應用于CNS感染性疾病的診斷中[10-11]。基因芯片技術在細菌性腦膜炎的診斷中也可見報道[6,12-13]。但這兩種方法都需要特定的儀器、設備和專業的人員,檢測成本較高,在快速檢測方面有不足之處。近年來,RPA技術以其快速、靈敏度高、特異性強的特點受到人們的關注,已應用于細菌、病毒和寄生蟲等檢測研究中[14-17]。RPA技術在恒溫條件下(25～43 ℃),20 min即可實現核酸指數擴增,這種常溫擴增的優點使得該技術不需要精密的儀器,為床旁診斷提供了可能,滿足了臨床快速診斷的需求。

LepA蛋白也被稱為 EF4,是與蛋白質翻譯密切相關的延伸因子,也是一個高度保守的蛋白,其編碼基因LepA在原核生物中具有高度的序列保守性[7]。有報道采用LepA 基因對血液中肺炎鏈球菌進行了核酸擴增檢測,研究發現肺炎鏈球菌的8株參考菌株和19株臨床分離株的檢測結果均為陽性,其余54株非肺炎鏈球菌菌株的檢測結果均為陰性,該研究表明LepA基因作為肺炎鏈球菌的檢測靶點具有較好的特異度和靈敏度[8]。

基于上述研究結果,本研究以LepA基因為分子診斷靶點,利用RPA技術檢測臨床CSF標本中的肺炎鏈球菌,以CSF微生物培養的結果作為標準,探討RPA技術的應用價值。

研究表明RPA技術檢測時間短,恒定40 ℃、20 min即可完成核酸的擴增,加上CSF DNA的提取和核酸產物凝膠電泳的時間,可以在1 d內得到檢測結果。在本研究中,RPA檢出肺炎鏈球菌的陽性率為26.9%(14/52),微生物培養技術檢出肺炎鏈球菌的陽性率為13.5%(7/52)。微生物培養結果為肺炎鏈球菌的7份CSF標本,其RPA檢測結果為陽性,兩種檢測方法結果一致。另外有7份CSF標本,其微生物培養結果為陰性,但是RPA檢測結果為陽性。這7例患者在本院就診前,均有當地醫院就診史,根據患者的資料信息,筆者認為這7例患者是因為使用抗菌藥物而降低了微生物培養的敏感性,患者CSF的中性粒細胞百分比為60%以上且中性粒細胞吞噬細菌的能力強,所以微生物培養結果為陰性,但是CSF中存在肺炎鏈球菌的核酸物質,因此RPA結果為陽性。需要注意的是,本研究中的RPA引物是檢測肺炎鏈球菌的特異性引物,所以微生物培養結果為非肺炎鏈球菌的標本RPA檢測結果為陰性。

為進一步確認RPA產物序列的正確性,將10份RPA陽性產物純化后與LepA基因目標序列進行核酸序列比對。從圖2可知,31號標本有9個位點的堿基與目的片段的堿基不一致,考慮31號標本中的肺炎鏈球菌在這9個位點發生了單個核苷酸的變異,其余9份RPA陽性產物的核酸序列與目標序列一致。該結果表明RPA成功擴增出目的基因片段。

RPA技術可快速、準確地檢測出CSF中的肺炎鏈球菌,有助于臨床對肺炎鏈球菌性腦膜炎的早期診斷和治療,也為細菌性腦膜炎其他病原菌的快速檢測提供借鑒。CSF病原菌的檢測方法,如微生物培養技術、革蘭涂片染色、免疫學及生化指標檢測等方法都各有優勢。RPA技術應該與這些檢測方法相互結合,相互補充,使得病原菌的檢測不斷向著簡單快速、準確度高、床旁適用的方向發展。