聚集誘導發光材料在細菌成像檢測和感染治療中的應用*

謝嶺平,賴麗莎,彭蘭芬 綜述,付文金△ 審校

1.廣東醫科大學附屬厚街醫院檢驗科,廣東東莞 523000;2.廣東醫科大學基礎醫學院,廣東東莞 523808

聚集誘導發光(AIE)現象于2001年由唐本忠團隊首次發現,AIE是指該類型的物質在稀溶液或單分子狀態下不發光,當它在高濃度或者形成聚集態時,熒光效應增強。不同于傳統有機熒光分子在低濃度(分散狀態)時發射熒光、在高濃度(聚集狀態)時易發生聚集熒光猝滅(ACQ)[1-2]現象,具有AIE性質的發光分子被稱之為聚集致發射發光物質(AIEgens)。AIEgens作為新型熒光材料,因其優異的光物理性能特別適用于細菌成像檢測和細菌感染治療。本文回顧了近幾年來AIEgens應用于細菌成像檢測和細菌感染治療方面取得的進展,現綜述如下。

1 AIEgens概述

1.1AIEgens的發光機制 熒光分子可通過發光發熱或分子物理運動等形式釋放吸收的能量。如早期的AIE原型分子四苯基乙烯(TPE),在稀溶液中,TPE分子四個苯環通過自由旋轉運動消耗能量,不發射熒光;當分子在聚集狀態時,苯環的自由旋轉空間受限,其分子高度扭曲的構型阻礙了分子間π-π相互作用,導致其熒光發射增強,稱為分子內旋轉受限(RIR)[3];另一類AIE分子內結構可通過以某一部分為軸而振動來消耗能量;由于聚集,分子內自由震動空間受限,激活發光分子,稱之為分子內振動受限( RIV)。RIR和RIV均屬于分子內運動受限(RIM)[4]。到目前為止,RIM被公認為是解釋AIE現象的主要機制[5]。

1.2AIEgens材料性能特點 AIEgens作為新型熒光材料,具有一系列獨特的優點,包括易制備、靈敏度高、背景低、聚集態發光效率高、光穩定性好、斯托克斯位移大等[6]。現有研究發現,AIEgens通過表面可修飾結構與光敏劑(PSs)、抗菌肽(AMPs)等多平臺結合來合成具有多功能的AIE探針,以便捷高效的方式實現了AIEgens生物體應用轉化,且合成探針均一性好,穩定性高,具有較高的可重復性及實用性[7]。在滿足生物安全性及優異性能的前提下有利于建立多功能的生物成像、診斷和治療系統,使AIEgens成為有前景和可靠的光學平臺[8]。

2 AIEgens用于細菌檢測

2.1AIEgens用于細菌成像檢測 AIEgens具有優良的光物理性能,根據細菌細胞膜不同的結構,受調控的AIEgens可以選擇性地點亮細菌,且不需要洗滌步驟[9],通過熒光信號可以有效地實現細菌的分類和鑒別,熒光定量檢測結果可動態反映細菌濃度的變化,特別適用于細菌的熒光成像檢測。ZHAO等[10]基于TPE開發了一種帶正電荷的新型AIE分子材料(TPE-Py-Br),帶正電荷的TPE-Py-Br和帶負電荷的細菌膜之間的靜電相互作用在細菌成像過程中起著關鍵作用。研究人員分別將革蘭陽性菌表皮葡萄球菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌在10-6mol/L濃度的TPE-Py-Br溶液中染色10 min,由于其AIE特性,溶液中分散的TPE-Py-Br分子保持不發光,TPE-Py-Br通過靜電力驅動與細菌膜結合形成局部聚集,激發出熒光,點亮細菌,兩種細菌均能清晰成像,實現細菌熒光成像檢測[10]。TPE-Py-Br和表皮葡萄球菌混合溶液的熒光發射強度比單獨的TPE-Py-Br溶液的熒光發射強度強15倍。即使在沒有洗滌過程的情況下,背景熒光非常低,發光效率高,避免了洗滌過程中的細菌丟失,簡化了成像步驟,提高了通過熒光強度來量化細菌濃度的準確性。熒光開啟細菌可視化,利用AIEgens能與多種細菌結合引起聚集誘導發光效應,其熒光強度與細菌量呈正比,高效的成像模式具有更高準確性和大線性關系區域的特點使AIEgens能夠進行高通量抗菌藥物篩選應用,為建立一種新型快速的細菌藥敏試驗方法提供了基礎。

2.2AIEgens用于細菌活性辨別 為辨別活細菌或死亡細菌,有研究者開發了3種AIE活性分子,即TPE-2BA、TriPE-3BA和TPE-4BA,TPE-2BA是一種能與雙鏈DNA凹槽結合的DNA染色劑,只有通過死亡細菌受損的細胞膜才能接觸到雙鏈DNA與其凹槽結合聚集激發出熒光[11]。因此,TPE-2BA 可以選擇性地對死亡的細菌(包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)進行染色,只對死亡細菌顯示其AIE特性。TriPE-3BA和TPE-4BA的苯環通過與靜電作用,與細菌細胞膜羥基結合聚集,導致旋轉受到限制,激發熒光,因此TriPE-3BA和TPE-4BA都可用于活菌染色[11]。

2.3AIEgens用于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的辨別 革蘭陽性菌引起的感染具有高發病率和病死率特點,對公眾健康造成較大威脅。為快速區分出革蘭陽性菌,便于指導臨床進行早期用藥,HU等[12]基于前期工作設計并合成了一種含嗎啉和萘基的AIEgens分子,即2-{[(二苯基亞甲基)腙]甲基}萘(M1-DPAN),其中嗎啉基團在選擇性識別革蘭陽性菌方面發揮了重要作用,通過改變微生物細胞壁之間的相互作用,聚集到革蘭陽性菌細胞壁表面,發出強熒光。當革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和白色念珠菌3種細菌同時與M1-DPAN作用20 min后,M1-DPAN在革蘭陰性菌和白色念珠菌的存在下也能選擇性地結合革蘭陽性菌,只在革蘭陽性菌上觀察到熒光反應,能很好地區分革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及白色念珠菌;在與金黃色葡萄球菌孵育后,M1-DPAN發射的熒光信號強且可以持續24 h,這有利于長時間動態可視化監測感染過程。ZHAO等[13]也合成了新型納米工程肽接枝超支化聚合物(NPGHPs),該AIE探針能對多種細菌,尤其是革蘭陰性菌有高效抗菌活性,其熒光強度與細菌量呈正比,并建立了大腸埃希菌濃度監測方法,檢出限達1×104cfu/mL,此外,AIE 探針NPGHPs對細菌的選擇性優于哺乳動物細胞,具有更廣闊的臨床應用前景。

2.4AIEgens對特定細菌的選擇性成像檢測 基于前期建立了各種細菌成像和檢測方法[14],AIEgens也可被設計成高通量傳感器陣列,用于快速準確地檢測細菌。ZHOU等[15]通過在四苯基乙烯上以烷氧基鏈為連接基團引入帶有明顯疏水性差異的季銨鹽,得到7種具有精確調節親疏水性的AIE分子四苯基乙烯衍生物(TPE-AR),構建了一系列基于TPE-AR的傳感器陣列來高通量地檢測和鑒別病原體。所檢測的7種微生物包括革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、耐青霉素的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌)、革蘭陰性菌(大腸埃希菌、耐氨芐西林大腸埃希菌和銅綠假單胞菌)及白色念珠菌。由于這些不同親疏水性的TPE-AR分子與病原菌間產生不同的多價相互作用,導致多樣的聚集行為,每種病原菌都呈現出不同特征的熒光信號,每個傳感器陣列都可以對不同的病原菌提供特征的熒光響應圖譜,通過線性判別分析病原菌的熒光模式,實現對7種病原菌的有效鑒定,該傳感器陣列也同樣適用于檢測病原菌混合物,具有快速(約0.5 h)識別、操作簡單、高通量和免洗等優點,有望用于高通量的細菌藥敏試驗,具有為臨床提供及時、可靠的病原菌篩查和藥敏試驗結果的巨大潛力。

3 AIEgens用于細菌感染治療

細菌感染是人類健康的重大威脅之一,抗菌藥物的過度使用導致了耐藥菌株出現和傳播,已成為人類面臨的嚴重健康問題[16]。因此,迫切需要研發新的抗菌方法來對抗細菌感染。本研究總結幾種基于AIEgens的圖像引導診療系統。

3.1AIEgens用于光動力治療(PDT)抗菌 PDT是一種利用特定波長的光激發光敏劑產生細胞毒性自由基和活性氧(ROS)以實現細菌感染治療的方法[17],由于其非侵入性和高時空選擇性的特點,具有抗菌效率高和不易產生耐藥性等優勢。PDT已經在腫瘤和細菌感染等疾病治療方面展現出巨大的優勢和應用前景[18]。基于AIEgens平臺搭載光敏劑(PSs),具有強光敏性的AIE-PSs在有效消除多重耐藥細菌方面表現出良好的性能[19],相對于傳統熒光材料,其不受 ACQ效應制約,具有更好的PDT效果。KANG等[20]報道了一種帶正電荷的近紅外(NIR)光動力治療探針(TTPy),由于更加小的單線態-三線態能量差,在白光的照射下能高效率地產生ROS,體外試驗表明TTPy可通過PDT有效殺滅金黃色葡萄球菌;體內試驗進一步地驗證了 TTPy 在光照下能夠明顯抑制金黃色葡萄球菌引起的小鼠傷口感染,試驗證明TTPy可選擇性染色并顯示出對革蘭陽性菌的有效光動力學殺滅效果。此外,LEE等[21]進一步開發了一種能快速區分革蘭陽性菌和高效光動力殺滅細菌的水溶性NIR AIEgens(TTVP),TTVP 僅孵育 3 s 就能對金黃色葡萄球菌實現特異性的免洗成像,隨著孵育時間(約5 min)延長,大腸埃希菌逐漸被染色。因此,通過控制孵育時間,該探針能夠超快速地區分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的混合樣品。TTVP 在白光照射下能夠更高效地產生ROS,金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌與TTVP一起孵育的存活率極低;TTVP 燈照組顯示出最佳的傷口愈合效果,體外試驗及體內試驗都證實了 TTVP有良好的光動力殺滅細菌的特性[21]。探索具有AIE特性的PDT系統對研發新型抗菌材料有非常重要的指導意義。

3.2AIEgens用于對抗多重耐藥菌 在耐藥菌的抗菌光敏劑設計方面,萬古霉素常用于治療革蘭陽性菌引起的嚴重感染[22],尤其是對其他抗菌藥物耐藥的耐甲氧西林菌株。有研究者通過AIE修飾萬古霉素,開發了一種多功能探針(AIE-2Van)用于革蘭陽性菌的PDT,在光照射下,AIE-2Van產生ROS并通過PDT過程選擇性地殺滅革蘭陽性菌[23]。與萬古霉素相比,AIE-2Van對耐萬古霉素腸球菌(VRE)菌株表現出更強的抗菌活性,最小抑菌濃度(MIC)為34.9 mmol/L,提示AIE-2Van對耐藥菌株的殺傷能力在本質上是通過ROS的產生得到提升的[23]。另有研究報道了一種基于AIEgens的細菌膜嵌入式光敏劑(TBD-anchor),得益于其本身AIE特征的單線態氧發生單元和靶向細菌膜的三季銨鹽,該光敏劑在水溶液里面具有高效的單線態氧產生效率與特異靶向細菌膜的功能,這有利于該光敏劑在白光光照下產生高效單線態氧而起到原位抗菌作用[24]。研究表明,TBD-anchor對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都具有非常高效的光動力抗菌能力,且在小于5 μmol/L濃度下TBD-anchor對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)都具有超過99.9%的殺菌作用;在800 nmol/L濃度下,TBD-anchor經10 min低劑量(25 mW/cm-2)的白光照射可以殺死99.8% MRSA[24]。這是首次報道基于AIE特征的光敏劑在低光強度下,在nmol級別濃度下依舊具有超強的多藥耐藥菌抗菌效果,為抗耐藥菌光敏劑的設計提供了一個新思路。

3.3AIEgens用于生物偶聯抗菌 生物偶聯是指兩種生物學上相關的分子通過共價鍵進行偶聯,這里具體是指將AIE化合物共價鍵合到生物相關分子上的技術。噬菌體(PAP)是專門感染和裂解細菌的病毒,與抗菌藥物相比更具有特異性,并對抗菌藥物耐藥菌株具有溶菌活性[25]。HE等[26]用帶PDT活性AIE分子TVP偶聯PAP合成(TVP-PAP),將靶向性、熒光成像和PDT效應集成在一起,受益于PAP生物學特性,非靶向細菌和正常哺乳動物細胞不受TVP-PAP影響。TVP-PAP在體外試驗中幾乎100%殺死了多重耐藥的銅綠假單胞菌,在體內試驗中加速了多重耐藥細菌感染傷口的愈合[26]。此外,抗菌肽 (AMPs) 是小型基因編碼的宿主防御蛋白,是哺乳動物免疫系統的關鍵組成部分,提供針對感染的內在防御,由于它們的廣譜活性和較低的細菌耐藥概率,它們已被作為有效的抗菌劑來治療細菌感染,特別是多重耐藥的細菌感染[27]。然而AMPs的殺菌機制仍不清楚,AIEgens和AMPs的偶聯設計可實現實時成像監測它們與陰離子細菌胞膜表面的相互作用,以及由此導致的病原菌完整性的破壞。另有研究者構建了具有正電荷表面和AIE特性的抗菌聚合物肽多糖(COS-AMP),COS-AMP具有廣譜抗菌性能,COS-AMP對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為241、334和233 mg/mL[28]。CHEN等[29]將抗菌肽HHC36和HBT結合在一起開發了一種具有AIE特性的抗菌肽 (AMP-2HBT),AIE活性探針能夠高密度標記細菌膜,通過熒光成像,可實時監測AMP的抗菌過程。在抗菌肽HHC36上修飾HBT分子以后,并沒有降低其抗菌活性。另外,透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡結果證明,HHC36通過在細菌細胞膜上的不斷聚集來破壞細菌膜完整性,從而實現有效殺滅細菌的目的。這些最新成果證明生物偶聯AIEgens能夠高效協同殺菌,在治療細菌感染方面具有良好的應用前景。

4 小結及展望

通過AIEgens作為可修飾的多功能平臺,實現了AIEgens在細菌成像檢測和細菌感染治療方面的應用。盡管在AIEgens基礎上對細菌的成像檢測和鑒別技術取得了較大進展,但對特定細菌的基于AIEgens的特異性成像檢測并沒有實現,例如AIEgens對結核分枝桿菌的特異性成像檢測,未來應探索AIEgens在特定細菌中的應用,以實現特異性的細菌成像。目前,AIEgens用于細菌治療研究集中于圖像引導的光動力療法,由于其具有非侵入性、高時空精度和低耐藥性等特點,是一個有前景的研究方向。然而細菌的檢測和治療性能主要由聚集的形成決定,目前基于AIEgens的細菌成像檢測技術的抗菌性能尚不能令人滿意,還需要進一步研究AIEgens的相關結構,提高ROS生成率,優化其在體內的生物降解性和生物相容性,實現病原菌的特異性靶向,探索更多簡便、經濟的方法來合成具有細菌檢測和抗菌劑協同效應的診療一體化材料,發揮精準抗菌的效果,促進AIEgens在細菌檢測和抗菌劑開發方面應用的進一步發展。