肺結核患兒外周血單個核細胞miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測價值

宋 煜,王雅楠,徐 於,王聿佳,熊 英△

陜西省康復醫院:1.檢驗科;2.兒科,陜西西安 710065

肺結核(PTB)是由結核分枝桿菌感染人體肺部引起的一種慢性傳染病,病情嚴重時可導致人死亡,是威脅人類生命健康安全的重大公共衛生問題之一[1]。相關調查數據顯示,兒童PTB在所有PTB患者中比例為10%,且兒童存在不同于成年人的發病特點,包括免疫學發病機制、臨床癥狀及預后轉歸等[2]。由于兒童PTB臨床表現普遍不典型,且目前診斷技術有限,難以實現早期準確診斷,易導致病情延誤,不利于患兒預后[3]。因此,尋找一種新型的標志物進行PTB早期診斷成為亟待解決的難題。微小核糖核酸(miRNA)是近年來發現的一類非編碼單鏈內源性小分子RNA,主要通過與相關堿基配對來調節靶基因或(和)調控蛋白表達,進一步參與疾病的發生、發展過程[4]。目前,國內外已有不少關于miRNA和PTB的研究[5-6],但主要集中在成人PTB中,關于兒童PTB和miRNA的關系研究鮮見報道。鑒于此,本研究通過分析PTB兒童外周血單個核細胞(PBMC)miRNA-31、miRNA-146a表達水平,以及上述指標與免疫細胞和炎癥因子的相關性,以期為兒童PTB的診斷和治療提供新的靶點和思路,現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年2月至2022年2月收治的75例PTB患兒作為觀察組,其中男45例,女30例;年齡3～12歲,平均(6.12±1.30)歲。另選取本院同期健康體檢的70例兒童作為對照組,其中男42例,女28例;年齡3～12歲,平均(6.09±1.32)歲。兩組年齡、性別比較,差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準:(1)觀察組所有患兒均符合《兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案(試行)》[7]中的診斷標準,對照組兒童體檢各項指標和檢查結果均無異常;(2)年齡≤12歲;(3)入組前未接受相關治療;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)神志異常;(2)合并重要臟器疾病;(3)伴有重大感染或免疫性疾病。所有研究對象監護人均知情本研究,并簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準。

1.2方法 (1)PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測:采用無菌肝素抗凝真空采血管采集所有兒童靜脈血3 mL,以密度梯度離心法分離PBMC。采用Trizol法提取標本總RNA,遵循miRNA反轉錄試劑盒(購自北京Invitrogen公司)獲取cDNA保存至—80℃冰箱中備用,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平。miRNA-31引物序列如下:上游引物為5′-GCCGCAGGCAGATGCTG-3′;下游引物為5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′。miRNA-146a引物序列如下:上游引物為5′-CATGATTGTATGACTGCACTC-3′;下游引物為5′-TCTTGCTAGGACTGACCA-3′。以U6作為miRNA內參,上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′;下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-31、miRNA-146a表達水平。(2)免疫細胞檢測:采用FCM型流式細胞儀(購自常州必達科生物科技有限公司)檢測T淋巴細胞亞群,指標包括CD3+、CD4+、CD8+比例,并計算CD4+/CD8+比值。相關抗體均購自金斯瑞生物科技股份有限公司。(3)炎癥因子檢測:抽取所有受試者空腹靜脈血3 mL,離心半徑8 cm,3 500 r/min離心10 min獲取血清,采用酶聯免疫吸附試驗檢測白細胞介素(IL)-2、IL-6、IL-8水平。所有操作均按照試劑盒說明書進行,試劑盒均購自深圳晶美生物科技有限公司。

1.3觀察指標 比較兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平,以及T淋巴細胞亞群、炎癥因子水平;分析PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的相關性,評估PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平單獨及聯合檢測診斷兒童PTB的效能。

2 結 果

2.1兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平比較 與對照組比較,觀察組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平均升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平比較

2.2兩組T淋巴細胞亞群水平比較 與對照組比較,觀察組CD3+比例、CD4+比例、CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組T淋巴細胞亞群水平比較

2.3兩組炎癥因子水平比較 與對照組比較,觀察組IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組炎癥因子水平比較

2.4PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子水平的相關性分析 Pearson相關分析發現,PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均呈負相關(P<0.05),與CD8+比例及IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的相關性分析

2.5PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測診斷兒童PTB的效能 ROC曲線分析結果顯示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平聯合檢測診斷兒童PTB的曲線下面積(AUC)均大于單項檢測,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5、圖1。

圖1 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測診斷兒童PTB的ROC曲線

表5 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測診斷兒童PTB的效能

3 討 論

結核病為常見的慢性傳染病之一,伴隨著病情的日益進展,可累及多個器官,且以PTB最多見,患者往往存在嚴重的肺組織損傷,進而導致肺功能降低,嚴重威脅健康及生命[8-10]。因此,早期實現有效診斷與及時治療PTB是國內外研究的熱點。miRNA不但扮演細胞內基因調控網絡關鍵分子的角色,亦是多種病理狀態下的重要生物標志物。近年來,已有不少研究報道證實,血液循環中的多種miRNA均可作為肺癌及肺炎等疾病的生物標志物[11-13]。血清中PBMC或PBMC中的miRNA檢測為疾病診斷、療效評估及個性化治療均提供了操作簡便的無創性檢測手段。因此,本研究通過分析兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平,以及上述指標與T淋巴細胞亞群和炎癥因子的相關性,對兒童PTB的診斷價值,旨在為上述兩項指標作為兒童PTB的臨床診斷標志物提供理論依據。

本研究結果表明,觀察組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平明顯高于對照組,這提示兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在異常高表達。可能是由于miRNA-31主要介導Janus激酶/信號與轉錄激活子(JAK/STAT)及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等多種結核感染有關信號通路,并通過對上述相關信號通路活性的調控,進一步抑制機體的免疫應答,最終引發結核分枝桿菌的感染[14]。miRNA-146a高表達會提升巨噬細胞對細胞內結核分枝桿菌的滅殺能力,進而抑制該致病菌的生長、繁殖,是機體應對結核分枝桿菌感染時的自然應答[15]。ROC曲線分析結果顯示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平聯合檢測診斷兒童PTB的AUC均高于單項檢測,差異均有統計學意義(P<0.05),提示臨床工作中可通過對上述兩項指標表達水平進行聯合檢測實現對兒童PTB的輔助診斷。此外,與對照組比較,觀察組CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差異均有統計學意義(P<0.05),提示結核免疫屬于細胞免疫,主要是由單核巨噬細胞介導的復雜免疫應答過程,而CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比值均是細胞免疫的重要指標。而PTB的發生會對患兒肺組織產生一定的損傷,進而影響免疫應答,最終導致上述指標的異常表達[16]。另外,與對照組比較,觀察組IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差異有統計學意義(P<0.05),提示IL-2、IL-6及IL-8均是臨床上應用較為廣泛的炎癥因子,在機體出現創傷、感染等狀況時,其在血清中水平急劇升高,可能對兒童PTB具有一定的輔助診斷作用。PTB患兒因肺組織遭受不同程度的損傷,進而導致上述指標出現應激性升高,并參與疾病的進展過程[17]。此外,Pearson相關分析發現,PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值水平均呈負相關(P<0.05),與CD8+、IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相關(P<0.05)。說明miRNA-31、miRNA-146a可能是通過靶向調控MAPK及JAK/STAT等信號通路,從而發揮炎癥免疫調控作用,進而參與PTB的發生、發展。

綜上所述,兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在明顯高表達,且與細胞免疫、炎癥因子均密切相關,可作為輔助診斷PTB的潛在生物學標志物,值得臨床重點關注。