單寧酸對低劑量T-2毒素誘導小鼠結腸黏膜損傷與菌群失調的保護效應

謝 旖,鄒酈睿,陶 冉,劉 莎,王江萍,文利新,鄔 靜,王 吉*

(1.益陽職業技術學院,益陽 413055;2.湖南農業大學動物醫學院畜禽保健湖南省工程中心,長沙 410128;3.長沙綠葉生物科技有限公司,長沙 410100)

T-2毒素是由寄居在多種農作物上的鐮刀菌屬霉菌產生的一種次級代謝產物,是一類具有強烈毒性的A類單端孢霉烯族真菌毒素,在中國的檢出率為80%[1],對我國乃至全球的糧食與飼料安全造成嚴重影響。T-2毒素毒性穩定、不易降解且廣泛存在于大麥、小麥、燕麥和玉米等谷物中[2],其毒力大小差異受諸多因素的影響,如接觸方式、暴露時間、染毒劑量等,往往幼年動物比成年動物表現更為敏感[3-4]。在嚙齒類動物模型中,T-2毒素的半數致死量(LD50)為5～10 mg·kg-1[5],且血漿中的T-2毒素通常在48 h內可全部清除[6]。T-2毒素中毒可分為急性、亞急性和慢性3種,短期大量攝入T-2毒素可導致急性中毒,動物表現為惡心、腹瀉、發育遲滯和體重減輕,嚴重時可導致死亡[7]。低劑量多次攝入T-2毒素可導致亞急性中毒,動物表現為反應遲緩,骨骼壞死,淋巴細胞減少和腦膜充血[8]。長期低劑量攝入T-2毒素可導致慢性中毒,動物表現為食欲下降、消化道黏膜損傷、神經內分泌紊亂、免疫系統損傷、皮膚壞死、生長抑制及母畜不孕、流產甚至死亡等[9]。已有研究表明,食用含有T-2毒素的飼糧會引起宿主腸道疾病,比如損傷腸道黏膜免疫應答[10]、干擾腸屏障功能[11]、改變腸道菌群組成[12]。目前,基于動物模型的T-2毒素毒理相關研究大多數為急性攻毒試驗,但我國飼料原料及畜禽配合飼料中T-2毒素的污染大多為低水平污染[13]。因此,慢性或亞急性T-2毒素暴露應當優先關注。

單寧(tannins)是一類多酚類化合物,廣泛存在于高粱、石榴、柿子以及豆科等糧食作物中。根據其化學結構,單寧主要分為縮合單寧(condensed tannin,CT)和水解單寧(hydrolyzable tannin,HT),CT是由兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素按照不同比例聚合而成聚合物,而HT則是由沒食子酸酯或含糖基的鞣酸及其衍生物組成,其中以單寧酸(tannic acid,TA)為典型[14-15]。一般而言,單寧易與體內的蛋白質、生物堿、多糖、核酸、細胞膜等大分子發生沉淀反應,過量攝入單寧會影響動物對營養物質的吸收與利用,并產生細胞毒性[15-17]。因此,在畜牧養殖業中,單寧通常被視為動物飼料中的抗營養因子。然而,TA中鄰位羥基的存在使其具有很強的清除氧自由基的能力,從而具備較強的抗氧化活性[15],動物日糧中適量添加的TA具有抗炎和抗氧化等生物學功能[18-19]。作者前期的研究證明,TA可通過調節死亡受體和線粒體凋亡信號通路修復玉米赤霉烯酮誘導的小鼠卵巢損傷[20]。此外,作者前期的預試驗還發現每日灌胃100 和200 mg·kg-1TA對小鼠各項生理指標及腸道健康無顯著影響,但400 mg·kg-1TA可造成小鼠的消化器官損傷。基于前期研究基礎,本研究以雄性C57BL/6J小鼠為模型,對小鼠進行低于LD50水平(1 mg·kg-1)的T-2毒素灌胃,且灌胃頻率為每周3次,持續10周,建立小鼠低劑量T-2毒素暴露模型,研究低劑量T-2毒素暴露對小鼠結腸組織病理學形態、結腸黏膜屏障和結腸菌群多樣性的影響,并評估安全劑量(100 mg·kg-1)的TA對T-2毒素誘導結腸損傷的保護效果,旨在為低劑量T-2毒素污染對動物腸道健康損傷的評估及其防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

T-2毒素購自普瑞邦生物工程有限公司,TA購自麥克林生化科技有限公司(上海);BCA蛋白檢測試劑盒購自杭州聯科生物科技有限公司;無水乙醇、氯仿、異丙醇、二甲苯、中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司;H&E染色液套裝(G1005)、AB-PAS染液套裝(G1049)購自武漢Servicebio公司;Trizol、Evo M-MLV反轉錄試劑盒和SYBR Green I試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;Western blot 蛋白Marker、一抗和二抗均購自湖南艾方生物科技有限公司;ECL試劑購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 動物試驗

36只6周齡雄性C57BL/6J小鼠,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。小鼠初始體重約為21 g,飼養于標準動物房[溫度(22±2) ℃,濕度(65±5%)]。實驗小鼠飼料為南通特洛菲飼料科技有限公司的LAD0011飼料,主要成分為小麥、玉米、次粉、豆粕,玉米蛋白粉、油脂、啤酒酵母、鹽、賴氨酸、蛋氨酸、礦物質、維生素。實驗小鼠隨機分為3組(每組12只):對照(Ctrl)組、T-2毒素(T2)組和TA干預(T2TA)組。T-2毒素溶于1%無水乙醇,用0.9%生理鹽水稀釋,T2組、T2TA組按照每日1 mg·kg-1劑量每周灌胃3次(Ctrl組灌胃無菌生理鹽水);TA溶于0.9%生理鹽水,T2TA組以每日100 mg·kg-1的TA劑量灌胃(Ctrl組和T2組灌胃無菌生理鹽水),試驗周期10周。試驗結束前一天晚上,禁食不禁水8 h。然后按0.01 mL·g-1劑量腹腔注射2.5%三溴乙醇麻醉,最后斷頸處死。試驗過程符合國家《實驗動物福利倫理審查指南》規定,并經湖南農業大學生物醫學研究倫理委員會批準(No.43322105)。

1.3 結腸組織病理學分析

各組截取5只小鼠結腸組織放至4%多聚甲醛組織固定液中充分浸泡,固定24 h,依次進行脫水浸蠟、包埋、切片制成石蠟切片。用于H&E染色、AB-PAS染色和免疫組化染色,鏡檢,采集圖像使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行統計分析。每組5個樣本,每個樣本組織切片按照左上、右上、中、左下、右下區域截取5個視野,于每個視野中進行杯狀細胞計數以及免疫組化陽性面積分析。H&E染色結果以100×和400×的切片鏡檢圖呈現,AB-PAS染色和免疫組化染色結果以100×和200×的切片鏡檢圖呈現。

1.4 實時熒光定量PCR

使用Trizol試劑從結腸組織中提取總RNA,使用Evo M-MLV反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。使用SYBR Green I試劑盒和qPCR儀對目的基因表達量進行測定,以β-actin作為內參,用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。測定的基因名稱和引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

1.5 Western blot

取出適量結腸組織,放入含有RIPA裂解緩沖液和PMSF的離心管冰浴勻漿,以12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,分離上清。以BCA法測定蛋白濃度,隨后在沸水中煮沸變性5 min。樣品蛋白在SDS-PAGE上分離,轉移到PEDF膜。加入一抗輕輕搖晃過夜,洗膜3次,加入二抗孵育1 h,洗膜3次。最后,用ECL試劑對蛋白條帶可視化,用Image-Pro Plus 6.0軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.6 16S rRNA測序

結腸菌群多樣性檢測試驗委托上海美吉生物醫藥科技有限公司基于Illumina Miseq PE300平臺完成。微生物群落總DNA抽提根據E.Z.N.A.?Soil DNA Kit說明書操作,使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16 S rRNA基因V3-V4 可變區進行PCR擴增,每個樣本3個重復。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫,利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序;對測序數據使用fastp軟件對原始測序序列進行質控,使用FLASH軟件進行拼接,使用UPARSE軟件,根據97%的相似度對序列進行運算分類單位(operational taxonomic units,OTU)聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva 16S rRNA數據庫(v138),設置比對閾值為70%。數據統計分析在美吉生信云平臺(https:∥www.majorbio.com)完成。

1.7 數據分析

2 結 果

2.1 TA緩解T-2毒素引起的小鼠結腸黏膜屏障損傷

如圖1A、B所示,3組小鼠結腸組織結構完好,黏膜完整,隱窩結構完整,排列整齊,未見明顯炎性細胞浸潤。但從AB-PAS染色結果及杯狀細胞數量統計中可以看出,與Ctrl組小鼠比較,T2組小鼠結腸黏膜杯狀細胞數量極顯著減少(P<0.01),而T2TA組相較于T2組小鼠結腸黏膜杯狀細胞數目顯著增加(P<0.05),且與Ctrl組無顯著差異(P>0.05)(圖1C～D、圖2)。

*.P<0.05,**.P<0.01,ns.P≥0.05

2.2 TA緩解T-2毒素引起的小鼠結腸通透性受損

如圖3免疫組織化學染色結果顯示,蛋白陽性表達呈棕黃色染色。T2組結腸黏膜中Occludin、Claudin1、ZO-1蛋白表達相較于Ctrl組均出現極顯著降低(P<0.01)(圖3A～I)。而TA干預可使Occludin、Claudin1、ZO-1蛋白表達均極顯著升高(P<0.01)(圖3A～I)。且T2TA組Claudin1蛋白表達極顯低于Ctrl組(P<0.01)(圖3C、D、H),而ZO-1蛋白極顯著高于Ctrl組(P<0.01)(圖3E、F、I)。

A～F.小鼠結腸Occludin、Claudin1和ZO-1免疫組化染色;G～I.小鼠結腸黏膜Occludin、Claudin1和ZO-1免疫組化陽性區域統計。**.P<0.01,ns.P≥0.05

與Ctrl組以及T2TA組相比,T2組的Occludin、Claudin1、Muc1以及Zo-1基因mRNA相對表達量均呈極顯著下降(P<0.01),且T2TA組OccludinmRNA相對表達量極顯著低于Ctrl組(P<0.01),Claudin1 mRNA相對表達量極顯著高于Ctrl組(P<0.01)(圖4A～C,E)。Muc2 mRNA各組間相對表達量無顯著差異(P≥0.05)(圖4D)。Western blot結果顯示,相較于Ctrl組,T2組Occludin和Claudin1蛋白表達量分別呈現顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)下降,而T2TA組相較于T2組,兩者均極顯著升高(P<0.01)(圖4F～H)。

A～E.小鼠結腸Occludin、Claudin1、Muc1、Muc2和Zo-1基因mRNA相對表達量變化;F～G.小鼠結腸Occludin和Claudin1蛋白表達量變化;H.Western blot蛋白電泳條帶。*.P<0.05,**.P<0.01,ns.P≥0.05

2.3 T-2毒素改變小鼠結腸菌群的多樣性

由圖5A～C中結腸菌群α多樣性分析可知,各組間OTU水平的Chao、Shannon及Shannoneven指數均無顯著差異(P>0.05),即各組小鼠結腸菌群的豐富度、群落多樣性以及群落均一性差異不顯著。Pd指數反映了樣本的譜系多樣性,Pd指數越大,說明物種進化多樣性越高。如圖5D所示,T2組的Pd指數與Ctrl組相比存在顯著差異(P<0.05),即T2組結腸菌群的進化多樣性顯著升高。如圖5E中OTU水平Venn分析所示,Ctrl組、T2組、T2TA組共檢出621個OTU,3組共同的OTU有448個,3組獨有的OTU數目分別為9個、34個和27個,Ctrl組和T2組共同的OTU有22個,Ctrl組和T2TA組共同的OTU有24個,T2組和T2TA組共同的OTU有57個。此外,在β多樣性分析結果中,PLS-DA分析可見各組樣本距離較遠,分別聚集在不同的象限中,即各組間小鼠的結腸菌群結構有一定的差異,主成分解釋度分別為13.06%和10.59%(圖5F)。

A～D.結腸菌群Chao指數、Shannon指數、Shannoneven指數和Pd指數;E.OTU水平Venn分析;F.OTU水平PLS-DA分析。*.P<0.05

2.4 TA改善T-2毒素誘導的小鼠結腸菌群變化

在門水平,各組相對豐度前5的物種依次為擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、脫硫弧菌門(Desulfobacterota)、放線菌門(Actinobacteriota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)(圖6A);差異物種分析結果顯示,T2組Patescibacteria豐度顯著高于T2TA組(P<0.05),且相對于Ctrl組呈升高趨勢(P≥0.05)(圖7A)。在目水平,各組相對豐度前5的物種依次為擬桿菌目(Bacteroidalea)、毛螺菌目(Lachnospirales)、乳酸桿菌目(Lactobacillales)、顫螺菌目(Oscillospirales)和脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)(圖6B);差異物種分析結果顯示,T2組Saccharimonadales豐度顯著高于T2TA組(P<0.05),且相對于Ctrl組呈升高趨勢(P≥0.05)(圖7B)。在屬水平,各組相對豐度前5的物種依次為norank_f__Muribaculaceae屬、Lachnospiraceae_NK4A136_group屬、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、unclassified_f__Lachnospiraceae屬和擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)(圖6C);差異物種分析結果顯示,T2TA組的顫桿菌屬(Oscillibacter)豐度顯著高于Ctrl組和T2組(P<0.05)(圖7C),Colidextribacter屬豐度顯著高于Ctrl組(P<0.05)(圖7D),norank_f__Oscillospiraceae屬豐度極顯著高于Ctrl組和T2組(P<0.01)(圖7E);T2組Candidatus-Saccharimonas屬顯著高于T2TA組(P<0.05)且相對Ctrl組呈上升趨勢(P≥0.05)(圖7F);T2組的臭氣桿菌屬(Odoribacter)極顯著高于Ctrl組和T2TA組(P<0.01)(圖7I),嗜膽菌屬(Bilophila)豐度顯著高于Ctrl組和T2TA組(P<0.05)(圖7J),且unclassified_f__Ruminoccaceae屬和丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)豐度相對Ctrl組和T2TA組呈升高趨勢(P≥0.05)(圖7G、H)。

A.小鼠結腸菌群門物種組成;B.小鼠結腸菌群目物種組成;C.小鼠結腸菌群屬物種組成

2.5 結腸菌群與結腸屏障相關指標關聯分析

進一步對小鼠結腸菌群物種豐度和結腸屏障相關指標進行了Spearman相關性分析,以此探究結腸菌群物種與結腸屏障之間的相關性。結果如圖8所示,Occludin和Zo-1 mRNA表達水平與脫硫桿菌屬豐度呈極顯著的正相關(P<0.001);Occludin蛋白表達水平與乳酸桿菌屬豐度呈極顯著負相關(P<0.01),與Lachnospiraceae_NK4A136_group豐度呈顯著正相關(P<0.05)。Claudin1蛋白表達水平與norank_f__Muribaculaceae和顫桿菌目豐度呈顯著正相關(P<0.05),與乳酸桿菌屬和Candidatus-Saccharimonas屬豐度分別呈極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)負相關。Muc2 mRNA表達水平與Lachnospiraceae_NK4A136_group豐度呈顯著正相關(P<0.05),與norank_f__Muribaculaceae豐度呈顯著負相關(P<0.05)。

3 討 論

本研究結果顯示,低劑量T-2毒素暴露不會造成小鼠結腸組織顯著的形態損傷和炎癥反應,但會使小鼠結腸中的杯狀細胞數量極顯著減少(圖2)。

而TA干預后的小鼠結腸中的杯狀細胞數量顯著增加。Kruppel樣轉錄因子-4(Kruppel-like factors-4,KLF4)是一類具有鋅指結構的轉錄因子,廣泛參與細胞增殖、分化及胚胎發育等多個生命活動的調控,特別是在結腸杯狀細胞的分化成熟過程中發揮重要作用[21]。研究表明,IL-8可以通過減少KLF4阻礙杯狀細胞的發育[22],因此,TA可能是通過增加結腸中KLF4來促進杯狀細胞發育,使杯狀細胞數量增加,這表明TA可以緩解低劑量T-2毒素暴露造成的結腸黏膜屏障受損,具有一定的保護結腸屏障功能的作用。而MUC1是最主要的黏蛋白之一,本研究結果顯示,低劑量T-2毒素降低小鼠結腸Muc1 mRNA的表達,而TA干預后其表達量顯著上升(圖4),驗證了TA改善T-2毒素誘導的小鼠結腸黏膜屏障,起到保護小鼠結腸黏膜屏障的作用。在Choi等[23]的研究中,給與肉雞飼糧中添加TA可增加腸道黏蛋白和緊密連接蛋白表達,提高腸道黏液屏障完整性,同時對腸道菌群也有積極影響,這與本研究結果相印證。

腸道上皮細胞機械屏障是保護腸道健康的另一重要因素,緊密連接蛋白在調節營養物質的運輸和防御抗原從管腔進入宿主體循環方面起著關鍵作用[24-25],其遭到破壞可增加腸道通透性,進而導致炎癥出現。緊密連接蛋白主要包括Claudin家族、Occludin家族和ZO家族,各類蛋白之間的相互作用有助于腸道緊密連接屏障的形成[26-27]。本研究結果顯示,T-2毒素可以導致結腸中Claudin1和Occludin的mRNA和蛋白表達量顯著下降,而TA干預可使之顯著升高(圖4)。同時,qPCR結果顯示,Zo-1 mRNA表達水平呈現相同的趨勢(圖4)。此外,免疫組化結果也證實了Claudin1、Occludin以及ZO-1蛋白表達水平具有相同趨勢(圖3)。上述結果表明,低劑量的T-2毒素暴露可導致小鼠結腸黏膜機械損傷,而TA的干預可有效緩解T-2毒素引起的腸道屏障損傷。據研究報道,在斷奶仔豬飼糧中添加TA可通過上調ZO-1等緊密連接蛋白mRNA的表達水平,起到改善腸道屏障的作用[28],TA還可顯著上調十二指腸中Occludin和Zo-2 mRNA的表達,降低豬腸道上皮通透性,改善腸屏障完整性[29],這些研究與本試驗結果相印證。

在本研究中,低劑量的T-2毒素暴露擾亂了小鼠結腸微生物的平衡,改變了結腸菌群結構,這與前人在其他動物模型中的研究結果相似[12]。已有研究證明,適量的TA不僅可以提高腸道對營養物質的吸收和利用,促進腸道健康,還可促進動物腸道內有益菌的增殖,同時抑制有害菌的生長,調節動物腸道菌群豐度的相對穩定[15]。Xu等[30]報道,飼料添加0.15%的TA可有效降低斷奶仔豬腹瀉,提高腸道屏障功能,改善腸道微生物群落結構。Liu等[31]研究發現,添加適量的TA可以促進腸道內產短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)細菌的生長,可以起到預防炎癥和維持腸道穩態的作用。微生物多樣性分析結果證明了TA的干預,一定程度上逆轉了T-2毒素引起的結腸菌群的改變(圖5)。

結腸菌群物種豐度及差異分析結果表明,TA的干預,可使T2組小鼠結腸中的Patescibacteria門、Saccharimonadales目、Candidatus-Saccharimonas屬、unclassified_f__Ruminoccaceae屬、臭氣桿菌屬以及嗜膽菌屬豐度顯著或極顯著降低。其中,Candidatus-Saccharimonas屬和嗜膽菌屬均已被證明是腸道內的有害菌,Candidatus-Saccharimonas屬豐度與結腸癌的發病成正相關[32],而高脂飲食會增加腸道中嗜膽菌屬豐度[33]。但也有研究發現,臭氣桿菌屬豐度的降低,結腸炎、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的發生有關[34],在本研究中,T2組臭氣桿菌屬豐度極顯著高于另兩組,但對結腸健康并未顯示出積極影響,可能與其在腸道菌群中的整體豐度較低有關。此外,TA的干預,可使T2組小鼠結腸中的顫桿菌屬和norank_f__Oscillospiraceae屬豐度分別顯著和極顯著升高(圖6、7)。其中,顫桿菌屬是已知的可產SCFAs并改善血脂的腸道有益微生物[35]。這些菌群的變化,證明了低劑量T-2毒素暴露會對結腸菌群多樣性及物種組成造成損害,而適量的TA干預具有顯著的改善效果。

本研究中的Spearman相關性分析結果顯示,小鼠結腸Occludin和Zo-1 mRNA表達水平與脫硫弧菌屬豐度呈極顯著的正相關(圖8);盡管已有報道表明脫硫弧菌屬與潰瘍性結腸炎、結腸癌和以肥胖、胰島素抵抗為代表的代謝綜合征的發生發展有關[36],但也有最新研究發現,植物提取物在改善高脂飲食誘導的小鼠代謝紊亂的同時,也促進了其腸道內脫硫弧菌屬豐度的升高[37],這可能與其屬水平下的不同種的功能差異有關。Occludin蛋白表達水平和Muc2 mRNA表達水平均與Lachnospiraceae_NK4A136_group豐度呈顯著正相關(圖8)。Lachnospiraceae_NK4A136_group屬為毛螺菌科NK4A136家族,毛螺菌科已被認為是一種有益的腸道微生物,可產生SCFAs,改善腸道炎癥及提高腸上皮屏障功能[38],這與本研究結論相一致。norank_f__Muribaculaceae屬和顫桿菌屬均屬于產SCFAs細菌,其豐度的增加與腸道免疫反應的改善有顯著相關性[35,39]。乳酸桿菌屬被普遍認為是一種有益于腸道健康的益生菌[40],但本研究中乳酸桿菌屬豐度與結腸屏障相關指標呈顯著負相關(圖8),可能與其在小鼠結腸中豐度較低有關。

4 結 論

低劑量T-2毒素暴露會導致小鼠結腸屏障損傷和結腸菌群的失調。而TA可以通過緩解T-2毒素造成的杯狀細胞數量減少、上調結腸黏膜屏障相關基因及蛋白的表達量水平,緩解T-2毒素引起的小鼠結腸黏膜損傷;同時通過調節T-2毒素誘導的結腸菌群失衡,降低有害菌群豐度、升高有益菌群豐度,最終有效改善小鼠的腸道健康。