基于RNA-Seq技術研究枸杞多糖對環磷酰胺致雛雞免疫抑制的拮抗機制

王建東,唐玉林,王 敏,張寶鎖,楊富強,高海慧,于 洋,郭延生*

(1.寧夏農林科學院動物科學研究所,銀川 750002;2.寧夏大學農學院,銀川 750021;3.寧夏銀川市婦幼保健院,銀川 750001;4.寧夏順寶現代農業股份有限公司,青銅峽 751600)

免疫抑制是免疫系統的一種暫時性或永久性紊亂,易由病毒、化學藥物、應激等多種因素引起,其中病毒引起的免疫抑制在畜禽中非常普遍[1]。近年來,單一或混合感染性免疫抑制病毒,如馬立克氏病病毒(MDV)、網狀內皮細胞增多癥病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)等廣泛存在于雞群中[2]。這些免疫抑制病毒往往會降低機體對疫苗免疫反應的敏感性,增加雞群傳染病的發病率和死亡率,給養雞業造成巨大的經濟損失[3]。當前控制免疫抑制病和預防繼發性感染的方法主要還是通過長期的疫苗接種和高劑量的藥物治療,然而滅活疫苗不能產生足夠的抗體,高劑量的藥物治療也面臨著動物產品中藥殘問題[4-5]。因此,尋找防治免疫抑制疾病的新方法迫在眉睫,而使用免疫增強劑來增強宿主的防御能力被認為是最有前途的替代方法[6]。近年來,一些傳統中藥制劑被證明具有免疫增強的作用,而進一步研究表明,其發揮免疫調節作用與其所含的活性成分植物多糖有著密切聯系。多糖是由糖苷鍵連接的單糖聚合物,在植物中廣泛存在,并被廣泛用作免疫調節劑[7]。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是從枸杞成熟果實中分離出的有效活性成分之一,主要由阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖6種單糖組成[8],且以半乳糖為主鏈結構組成[9]。據報道,LBP具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強免疫、生殖保護及神經保護等作用[10-14]。Long等[15]研究發現,在肉雞日糧中添加LBP能顯著提高肉雞生長性能,增強機體抗氧化應激能力,并增加血清中IgG、IgA、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平。王思月[16]研究表明,LBP能夠顯著改善肉雞腸道菌群結構,提高血中IgA和IgG水平,并增加IL-2和IL-6基因的表達水平,從而達到增強免疫的作用,但目前關于枸杞多糖對雛雞免疫抑制調節的分子機制尚未見報道。

環磷酰胺(cyclophosphamide,CY)是一種常被用于腫瘤化療的藥物,但其靶向性不強,在殺傷腫瘤細胞的同時會殺傷如淋巴細胞在內的大量免疫細胞,導致機體出現免疫抑制等嚴重副作用,可用來構建免疫抑制模型。因此,本試驗采用RNA-Seq技術研究LBP對環磷酰胺所致免疫抑制雛雞脾組織基因的調節作用,旨在揭示LBP干預雛雞免疫抑制的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要動物與藥品

1日齡雛雞購自北京華都峪口禽業有限公司;枸杞多糖購自寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司;環磷酰胺購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 試驗動物分組與處理

將120羽1日齡海蘭褐蛋雞,適應性飼養至7日齡后隨機分成3組,每組40羽,即空白組(NC組)、環磷酰胺組(CY組)及枸杞多糖組(CYLbGp組),NC組連續3 d肌注生理鹽水,其余2組連續3 d每日肌注80 mg·kg-1環磷酰胺進行造模,造模后CYLbGp組通過飲水的方式每日給予5 mg·kg-1枸杞多糖,連續30 d。在CYLbGp組給藥結束后第1天,每組隨機選取6只雞處死后取脾組織于凍存管中,-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 測序試驗流程

使用TRIzol試劑(Invitrogen)從雛雞脾組織樣品中提取總RNA,隨后利用Nanodrop2000、瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度及完整性,再使用Agilent 2100測定RNA完整值(RNA integrity number,RIN)。加入buffer后,利用帶有Oligo(dT)磁珠分離出300 bp左右mRNA的小片段,加入隨機引物合成一鏈cDNA,隨后進行二鏈合成。將得到的雙鏈cDNA進行PCR擴增(15個cycles),最后在cBot系統上進行橋式PCR擴增,完成整個文庫的制備工作。將構建好的文庫用Illumina NovaSeq6000平臺進行測序(PE文庫,讀長2×150 bp)。

1.4 RNA-Seq質量評估和序列比對

對原始測序數據進行過濾,得到高質量測序數據(Clean data)。使用SeqPrep、Sickle等在線平臺修剪、剔除測序數據中的問題片段,再對過濾所得到的高質量測序數據進行質量評估,計算Q20、Q30(Q20、Q30分別指測序質量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比)和GC含量,同時選擇對應的測序堿基平均錯誤率(Error rate)小于0.1%的用于后續的轉錄組分析。將得到的高質量測序數據與參考基因組進行比對,獲得用于后續分析的比對率(Mapped data),同時對本次測序的比對結果進行質量評估,并使用TopHat2軟件進行序列比對分析。

1.5 轉錄組數據分析

獲得基因的Read Counts數后,使用RSEM軟件對其進行TPM(Transcripts per million)轉換,進而得到標準化的基因表達水平。利用軟件DESeq2篩選出各組樣本間差異表達基因(|log2(Fold change)|≥0,P-adjust<0.05)。利用Blast2go 2.5對基因集進行GO注釋分析,采用軟件Goatools對基因集內的基因進行GO富集分析,使用KOBAS對基因集內的基因進行KEGG通路富集分析,篩選差異表達基因顯著富集的途徑。

1.6 蛋白質互作網絡分析

使用String 11.5(http:∥string-db.org/)平臺構建枸杞多糖回調差異基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析圖(PPI),選擇多種蛋白模式(Multiple proteins),將所篩選的差異基因名導入模塊(List Of Names),從物種類別里選擇雞(Gallusgallus)進行搜索,將所得圖片數據下載后導入Cytoscape3.8.2軟件進行調整,使用Analysis Network進行分析獲得Degree值,根據Degree值的大小進行相關基因節點的繪制,進一步挖掘枸杞多糖在拮抗免疫抑制網絡中的重要基因。

1.7 RT-qPCR驗證

從差異表達基因中隨機挑選5個差異基因CD83、CCL4、PSPH、LPIN2和ULK2,以β-actin為內參基因,采用RT-qPCR法驗證轉錄組測序結果的準確性。所用引物經上海美吉生物醫藥科技有限公司合成,見表1。RT-qPCR反應體系為20 μL,2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL,50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 6 μL。反應條件為:95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,40個循環。采用2-ΔΔCT法測定與對照組相比試驗各組基因的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結 果

2.1 免疫抑制雛雞模型判斷

CY組和CYLbGp組雛雞在肌注3 d環磷酰胺后,外觀明顯可見精神狀態萎靡不振、喜臥、閉目呆立、羽毛凌亂、少食,出現體重減輕,表明免疫抑制雛雞模型建立成功。前期研究中也發現,環磷酰胺所致免疫抑制雛雞可出現脾臟指數、淋巴細胞轉化率顯著降低,脾組織結構較正常組生發中心減少[17-18]。

2.2 測序數據質量評估與序列比對

3個試驗組的脾組織樣本轉錄組測序后數據質量評估和序列比對詳細結果見表2。結果顯示,對各組樣本進行轉錄組測序后,NC組、CY組和CYLbGp組分別共獲得363 058 878、330 263 170和355 979 838條原始測序數據條目數,對原始數據進行質控、過濾后分別共獲得了357 135 798、324 728 438和350 233 042個測序條目數。測序所得數據的各樣本Q20、Q30的最小含量分別為97.39%、93.05%(一般Q20在85%以上,Q30在80%以上被認為測序質量可靠),GC含量在50.16%～52.40%之間,且所有樣品的唯一比對率均達到83.76%以上。質量評估結果表明,本次轉錄組測序數據質量較高、結果可靠,可用于后續分析。

表2 測序數據質量處理與序列比對

2.3 轉錄組樣本關系分析

利用比對至基因組的結果以及基因組注釋文件,獲得每個樣本基因的Read Counts。然后使用RSEM對其進行TPM轉換,進而得到標準化的基因表達水平。依據得到的TPM數據進行小提琴圖繪制,如圖1所示。

圖1 3組樣本基因表達量小提琴圖

PCA分析基于基因表達量對樣本進行聚類,圖中樣本間的距離遠近,表明樣本間相似性的高低,距離越近相似性越高。為了解各樣本間和組間差異基因的表達情況,采用DESeq軟件進行PCA分析,見圖2。結果表明,3組雛雞脾樣本表達結果均處于95%置信區間內,表明各組組內脾樣本基因表達情況相似,數據穩定性好,樣本可信度高。CYLbGp組和NC組基因表達輪廓重合,表示兩組基因表達水平無明顯差異,而CY組較NC和CYLbGp兩組樣本的組間差異大,基因表達水平發生明顯改變,提示CY顯著改變了雛雞脾的基因表達情況,而LBP對CY刺激產生的影響有明顯改善作用。

圖2 3組樣本間PCA得分圖

2.4 差異表達基因篩選

NC和CY組、CY和CYLbGp組之間以P-adjust<0.05和|log2FC|≥0為標準篩選差異表達基因,結果見圖3。如圖所示,與NC組相比,CY組篩選出差異表達基因有408個,其中上調193個,下調215個。與CY組相比,CYLbGp組共篩選出差異表達基因896個,其中上調了408個,下調488個。為明確LBP拮抗CY免疫抑制作用的主要靶基因,篩選CY組較NC組上調的差異表達基因與CYLbGp組較CY組下調差異表達基因的交集,得到108個差異表達基因;將CY組較NC組下調的差異表達基因與CYLbGp組較CY組上調差異表達基因的交集,得到70個差異表達基因(圖4)。

圖3 差異表達基因火山圖

A.與NC組相比,CY組上調的差異表達基因數目,以及與CY組相比,CYLbGp組下調的基因數目;B.與NC組相比,CY組下調的差異表達基因數目,以及與CY組相比,CYLbGp組上調的基因數目

2.5 差異表達基因的GO功能注釋分析

對枸杞多糖干預后上、下調差異基因集進行GO功能注釋分析,結果主要分為三個模塊:生物過程主要涉及到細胞過程、生物調節等,細胞成分主要涉及細胞部分、膜部分、膜、細胞器部分、細胞器等,分子功能主要涉及結合、催化活性等。結果如圖5、6所示。

cell part:細胞部分;membrane:膜;organelle:細胞器;organelle part:細胞器部分;membrane part:膜部分;protein-containing complex:蛋白復合體;synapse:突觸;cellular process:細胞過程;biological regulation:生物調節;metabolic process:代謝過程;response to stimulus:對刺激的反應;localization:本地化;developmental process:發展過程;cellular component organization or biogenesis:細胞組成組織或生物發生;multicellular organismal process:多細胞生物過程;multi-organism process:多組織過程;binding:結合;catalytic activity:催化活性;molecular transducer activity:分子換能器活性;transcription regulator activity:轉錄調控因子活性

2.6 差異表達基因的GO功能富集分析

為研究枸杞多糖干預免疫抑制雛雞后差異表達基因的生物學功能,對給予枸杞多糖后發生顯著改變的差異基因進行GO功能富集分析。其中在CY刺激后上調,給予枸杞多糖干預后下調的108個基因顯著富集到6個屬于生物過程模塊的GO條目(P-adjust<0.05)上,如圖7所示,生物質量調節、細胞對化學刺激的反應、生物調節、多細胞生物過程的調節、穩態過程、化學反應。在CY刺激后下調,給予枸杞多糖干預后上調的70個基因也顯著富集于23條GO BP條目上(Padjust<0.05),見圖8。其中許多條目與免疫調節相關,包括免疫系統過程的正向調節、淋巴細胞活化、免疫系統過程、免疫系統過程的調節、白細胞活化、白細胞分化、白細胞-細胞黏附的調節等生物學過程。

cell part:細胞部分;membrane:膜;organelle:細胞器;membrane part:膜部分;organelle part:細胞器部分;protein-containing complex:蛋白復合體;binding:結合;catalytic activity:催化活性;transcription regulator activity:轉錄調控因子活性;transporter activity:運輸活動;biological regulation:生物調節;cellular process:細胞過程;localization:本地化;metabolic process:代謝過程;developmental process:發展過程;cellular component organization or biogenesis:細胞組成組織或生物發生;response to stimulus:對刺激的反應;immune system process:免疫系統過程;locomotion:運動;multicellular organismal process:多細胞生物過程

response to chemical:對化學物質的反應;homeostatic process:穩態過程;regulation of multicellular organismal process:多細胞生物過程的調節;biological regulation:生物調節;cellular response to chemical stimulus:細胞對化學刺激的反應;regulation of biological quality:生物質量調節

caicium ion transport:鈣離子遷移;cell activation:細胞活化;regulation of leukocyte cell-cell adhesion:白細胞-細胞黏附的調節;regulation of cellular component movement:調節細胞成分的運動;cell motility:細胞活性;regulation of cell-cell adhesiorr:細胞-細胞黏附的調節;regulation of locomotion:運動調節;leukocyte differentiation:白細胞分化;movemenf of cell or subcellular component:細胞或亞細胞成分的運動;leukocyte activation:白細胞活化;intracelular signal transductior:細胞內信號轉導器;regulation of cell motility:細胞運動的調節;regulation of immune system process:免疫系統過程的調節;locomotion:運動;regulation of cell migration:細胞遷移的調節;immune system process:免疫系統過程;positive reguiation of locomotiorr:積極調節運動能力;positive regulation of celluiar component movemet:細胞成分運動的正向調節;positive regulation of cell motility:細胞運動的正向調節;metal ion transport:金屬離子運輸;positive regulation of cell migratiorr:正向調節細胞遷移;lymphocyte activation:淋巴細胞活化;positive regulation of immune system process:免疫系統過程的正向調節

2.7 差異表達基因的KEGG通路富集分析

對178個枸杞多糖干預后發生顯著回調的差異表達基因進行KEGG通路富集分析。結果顯示,CY刺激后發生上調,在給予枸杞多糖干預后發生下調的108個差異基因顯著富集通路有13條,主要涉及到線粒體自噬-動物、mTOR信號通路和AMPK信號通路等與細胞自噬相關通路上(圖9)。在CY刺激后發生下調,給予枸杞多糖干預后發生上調的70個差異基因顯著富集通路有79條,主要涉及到趨化因子信號通路、C型凝集素受體信號通路、B細胞受體信號通路、血小板活化、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、Th1和Th2細胞分化等免疫相關信號通路上(圖10)。去除掉未知基因后共有17個差異表達基因被富集到上述通路中(表3)。

Mitophagy-animal:線粒體自噬-動物;cGMP-PKG signaling pathway:cGMP-PKG信號通路;Pathways in cancer:癌癥通路;Thyroid hormone signaling pathway:甲狀腺激素信號通路;Adipocytokine signaling pathway:脂肪細胞因子信號通路;Longevity regulating pathway-worm:壽命調節通路-蟲;PPAR signaling pathway:PPAR信號通路;mTOR signaling pathway:mTOR信號通路;Salivary secretion:唾液分泌;Fatty acid degradation:脂肪酸降解;Mineral absorption:礦物質的吸收;AMPK signaling pathway:AMPK信號通路;Longevity regulating pathway-multiple species:長壽調節途徑-多物種

Chemokine signaling pathway:趨化因子信號通路;Ras signaling pathway:Ras信號通路;C-type lectin receptor signaling pathway:C型凝集素受體信號通路;Phosphatidylinositol signaling system:磷脂酰肌醇信號系統;Spinocerebellar ataxia:脊髓小腦的共濟失調;Non-small cell lung cancer:非小細胞肺癌;Platelet activation:血小板活化;Human immunodeficiency virus 1 infection:人類免疫缺陷病毒1型感染;cAMP signaling pathway:cAMP信號通路;Shigellosis:志賀菌病;Proteoglycans in cancer:蛋白質多糖在癌癥中的作用;B cell receptor signaling pathway:B細胞受體信號通路;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路;Natural killer cell mediated cytotoxicity:自然殺傷細胞介導的細胞毒性;PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer:PD-L1在癌癥中的表達和PD-1檢查點通路;Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection:卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染;Cholinergic synapse:膽堿能突觸;Parathyroid hormone synthesis,secretion and action:甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用;Th1 and Th2 cell differentiation:Th1和Th2細胞分化;Inflammatory mediator regulation of TRP channels TRP:通道的炎性介質調節

表3 枸杞多糖干預免疫抑制雛雞KEGG篩選的通路及富集基因

2.8 差異表達基因PPI網絡分析

枸杞多糖干預后回調差異表達基因PPI網絡圖,如圖11所示。結果表明,PIK3CD、JAK3、GATA3、HIF1A、NKX2-5和INPPL1為其中的關鍵基因,除NKX2-5外均為上述篩選差異通路中的富集基因,可能作為枸杞多糖拮抗雛雞免疫抑制的藥效靶點。

圖11 枸杞多糖干預回調差異表達基因PPI網絡圖

2.9 RT-qPCR驗證結果

RT-qPCR驗證結果表明,CD83、CCL4在枸杞多糖干預后表現出上調的趨勢,PSPH、LPIN2、ULK2呈現為下調趨勢,并且與轉錄組學數據變化趨勢基本一致(圖12),表明轉錄組數據的有較高的可靠性。

A.RNA-seq所檢測5個基因的相對表達水平;B.qRT-PCR所檢測5個基因的相對表達水平。*表示與NC組差異顯著(P<0.05),**表示與NC組差異極顯著(P<0.01);#表示與CY組差異顯著(P<0.05),##表示與CY組差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

CY因其良好的免疫抑制效果,常被用于免疫抑制模型的建立。研究表明,CY通過抑制機體免疫器官的發育、降低免疫細胞數量和減少免疫相關細胞因子產生達到免疫抑制的效果,而LBP可通過調節各種免疫細胞活化、分化,及促進免疫分子的分泌達到免疫增強的作用[19-20]。

3.1 枸杞多糖對細胞凋亡的影響

本研究發現,LBP干預后,下調的108個共表達基因最主要顯著富集在線粒體自噬信號通路上,下調的關鍵基因為缺氧誘導因子-1a(HIF1A)。HIF-1a是一種PAS家族轉錄因子,可調節代謝對組織氧環境變化的適應。在常氧條件下,HIF-1a被脯氨酰羥化酶迅速降解。在缺氧條件下,HIF-1a穩定并與組成型表達的HIF-1b形成異二聚體,并與調節不同生物過程的基因中的缺氧反應元件結合[21]。HIF1A在缺氧適應性反應中特異性表達,可能參與脊髓損傷后繼發性缺血缺氧過程,并可能介導損傷性細胞凋亡[22]。在快速生長的腫瘤中,細胞通常會遇到缺氧應激,從而導致HIF表達的誘導,誘導細胞凋亡[23]。研究表明,CY也可造成再生障礙性貧血,常被用于動物貧血模型的建立[24],并使血清中HIF-1a表達水平升高[25]。本試驗中CY組脾組織中HIF1A表達上升,提示CY可造成機體貧血引起HIF1A表達上調,誘導細胞凋亡,給予LBP干預后HIF1A表達水平顯著降低,表明LBP能夠改善脾免疫細胞凋亡情況,進而緩解雛雞免疫抑制作用。

3.2 枸杞多糖對免疫功能的影響

轉錄組分析發現,許多差異表達基因與免疫反應相關,所涉及到的關鍵基因包括PIK3CD、GATA3和JAK3。PIK3CD是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族的成員,是細胞代謝、增殖、分化和凋亡等細胞功能中的關鍵信號調控樞紐[26]。PIK3CD主要在白細胞中表達,可能占B淋巴細胞中PI3K活性的60%,是B細胞發育和存活所必需的[27]。細胞中PIK3CD含量降低會阻止B細胞分化并減少循環中成熟B細胞的數量,這表明其在B細胞濾泡成熟和存活中不可或缺的作用[28]。本試驗中,給予LBP后PIK3CD表達水平較CY組出現顯著上調。

T細胞轉錄因子基因GATA3分別是Th1和Th2細胞的關鍵轉錄因子,可促進T細胞活化與分化,并且在多種炎癥反應中具有重要作用[29]。JAK3是酪氨酸激酶家族的重要成員之一,在轉導來自IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15受體的信號中起關鍵作用,對T細胞和B細胞的增殖分化以及在維持機體的免疫系統穩態中發揮重要作用[30]。本試驗中,給予LBP后GATA3、JAK3表達水平較CY組出現顯著上調。

INPPL1(又稱SHIP2)是一種抑制性磷酸酶,對肌醇磷脂磷脂肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)具有特異性[31]。SHIP通過水解PIP3作為免疫反應的負調節因子,而PIP3作為脂質第二信使,對機體各免疫細胞的發育和功能起到調控作用[32]。本試驗中,給予LBP后INPPL1表達水平較CY組出現顯著上調。

綜上可見,LBP具有緩解雛雞免疫抑制的作用。

4 結 論

本試驗采用轉錄組學方法探究枸杞多糖拮抗雛雞免疫抑制的作用機制,與NC組/CY組鑒定出的差異表達基因比較,發現LBP回調的差異表達基因有178個,其中上調基因70個,下調基因108個,顯著逆轉調節富集通路有92條。結果表明,LBP可通過調節線粒體自噬、趨化因子信號通路、C型凝集素受體信號通路、B細胞受體信號通路、血小板活化、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、Th1和Th2細胞分化等通路,起到抑制細胞凋亡,提高免疫功能的作用。