2D-UPLC-Q/TOF-MS法對(duì)替考拉寧未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

邵伍軍?和燕玲?袁紅露?周雪飛?陳延安?覃玉梅?金美春?楊荷友

摘要：目的 建立一種在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（2D-UPLC-Q/TOF-MS）分析方法對(duì)替考拉寧未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。方法 采用在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法，一維液相進(jìn)行分離，二維液相脫鹽后進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)雜質(zhì)精確分子量及其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子與已知主成分結(jié)構(gòu)碎片離子對(duì)比，推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)。結(jié)果 該方法采用2D-UPLC-Q/TOF-MS法對(duì)替考拉寧未知雜質(zhì)進(jìn)行鑒定，鑒定雜質(zhì)1為A3-1脫N-乙酰基葡萄糖降解物，雜質(zhì)2為A2-2脫甘露糖降解物。結(jié)論 該方法可以快速地對(duì)替考拉寧未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，很好地解決了雜質(zhì)難以制備進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的難題。

關(guān)鍵詞：在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（2D-UPLC-Q/TOF-MS）；替考拉寧；未知雜質(zhì)；結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號(hào)：R978文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identify the unknow impurity structures in teicoplanin by 2D- UPLC-Q/TOF-MS

Shao Wu-jun， He Yan-ling， Yuan Hong-lu， Zhou Xue-fei， Chen Yan-an， Qin Yu-mei， Jin Mei-chun， and Yang He-you

（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co， Ltd.， Taizhou 318000）

Abstract? ? Objective To establish a two dimension-ultra high performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry（2D-UPLC-Q/TOF-MS） method for the structural analysis of unknown impurities in teicolanin. Methods The impurities were separated by 1D-UPLC， the salt was desalted by 2D-UPLC and the impurities were analyzed by Q/TOF-MS. The impurity structures were identified by accurate molecular weight of the impurities and the fragment ions of the mass spectrometry comparing with the fragment ions of the known principal component structure. Results The unknown impurities of teicolanin were identified by 2D-UPLC-Q/TOF-MS method. The impurity 1 was identified as the degradation product of A3-1 removing N-acetylglucosamine， and the impurity 2 was the degradation product of A2-2 removing mannose. Conclusion This method can be used to identify the structure of the unknown impurities in teicolanin， which solves the problem that it is difficult to prepare the impurities for structural analysis.

Key words? ? Two dimension-ultro performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometer （2D-UPLC-Q/TOF-MS）; Teicoplanin; Unknow impurity; Structure identification

替考拉寧是一種糖肽類抗生素，用于嚴(yán)重的革蘭陽性菌感染，主要由5個(gè)結(jié)構(gòu)相似的化合物A2-1、A2-2、A2-3、A2-4、A2-5組成，其中A2-2為主要組分，占各組分相對(duì)含量的40%以上[1-2]。《中國藥典》2020版或《歐洲藥典》10.0中替考拉寧主組分結(jié)構(gòu)見圖1和表1[3-4]。

替考拉寧結(jié)構(gòu)由七肽組成的苷元母核、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖及其側(cè)鏈組成[5]。目前替考拉寧主組分和雜質(zhì)的分析方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相-核磁聯(lián)用等。Baran等[6]通過核磁、質(zhì)譜技術(shù)對(duì)替考拉寧的5個(gè)主成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。Tengattin等[7]通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定A3-1組分是A2-2水解脫去氨基葡萄糖及其側(cè)鏈而形成。Cometti等[8]通過液相-核磁聯(lián)用及氣相質(zhì)譜技術(shù)對(duì)替考拉寧兩個(gè)雜質(zhì)R'端的側(cè)鏈進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。Borghi等[9]等通過制備技術(shù)與核磁對(duì)替考拉寧的4個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。張含智等[10]通過高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜推導(dǎo)了11個(gè)具有替考拉寧母核組分和4個(gè)脂肪酰基-氨基葡萄糖化合物。由于替考拉寧化學(xué)組成復(fù)雜，通過雜質(zhì)制備進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定方法尤為重要。文獻(xiàn)中的一維液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，由于質(zhì)譜檢測(cè)器的特殊性，流動(dòng)相只能使用易揮發(fā)性鹽或酸，所以一維液相-質(zhì)譜聯(lián)用需更換原液相方法中的流動(dòng)相為易揮發(fā)鹽或酸，這樣很難確定液相質(zhì)譜方法色譜峰與原液相方法色譜峰的一致性。本文通過在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)替考拉寧未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，一維液相使用原液相方法，二維液相使用適合質(zhì)譜檢測(cè)器的流動(dòng)相，檢測(cè)結(jié)果既可以與原流動(dòng)相方法色譜保留時(shí)間一一對(duì)應(yīng)，也可以使用高分辨質(zhì)譜結(jié)果對(duì)主組分和雜質(zhì)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜對(duì)比研究，通過一級(jí)質(zhì)譜確定其精確質(zhì)荷比，推測(cè)其分子式，通過主組分裂解方式推測(cè)雜質(zhì)的裂解方式并確定其結(jié)構(gòu)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

在線二維超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配有Xevo G2-XS Q/TOF-MS四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ACQUITIY UPLC 2D液相系統(tǒng)及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（德國Merck公司）。

1.2 主要材料與試劑

色譜級(jí)乙腈購自德國Merck公司；質(zhì)譜級(jí)甲酸銨、甲酸購自德國Sigma公司；其余試劑均為分析純；替考拉寧（浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)2121-S200401）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 一維色譜條件

色譜柱：ODS Hypersil（4.6 mm×250 mm， 5 ?m）；波長(zhǎng)：254 nm；流速2.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20.0 ?L；稀釋劑：水；流動(dòng)相A：3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)pH 6.0）/乙腈=9/1，流動(dòng)相B：3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)pH 6.0）/乙腈=3/7；梯度洗脫，流動(dòng)相B的梯度變化： 0～34.50 min：0%～50%；34.50～35.60 min：50%～90%；35.60～40.25 min：90%～90%；40.25～47.15 min：90%～0；47.15～51.00 min：0～0。

1.3.2 二維色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm ×2.1 mm， 1.7 ?m）；流速：0.5 mL/min；柱溫：45℃；流動(dòng)相A：0.01 moL/L甲酸銨pH 6.0），流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫，流動(dòng)相B切縫脫鹽后由2%到80%。

1.3.3 質(zhì)譜條件

ESI源；正離子模式；離子源溫度120℃；霧化氣流速900 L/h；霧化氣溫度500℃；毛細(xì)管電壓2500 V；錐孔氣流速50 L/h；錐孔電壓60 V；采集范圍100～2500 u；采集模式MSE/MSMS，MSE碰撞能量20～50 eV。

1.3.4 操作步驟

取替考拉寧適量，用稀釋劑制成2 mg/mL替考拉寧溶液，取20 ?L注入一維液相色譜儀，通過一維液相紫外色譜圖確定各峰的出峰位置，分別對(duì)各峰進(jìn)行中心切割，二維液相色譜方法中設(shè)置閥切換時(shí)間，將目標(biāo)峰收集于定量環(huán)中，再通過閥切換將各目標(biāo)峰從定量環(huán)中反沖至二維色譜柱上分離并脫鹽，最后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用MSE/MSMS采集模式，同時(shí)得到一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜。使用軟件通過精確質(zhì)荷比和同位素分布進(jìn)行元素組成分析，確定分子式，結(jié)合替考拉寧各組分的二級(jí)質(zhì)譜信息和未知雜質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜碎片推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 一維色譜結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用在線二維超高效液相高分辨質(zhì)譜方法建立了替考拉寧主成分及主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定方法，一維液相中色譜方法為《中國藥典》2020版或《歐洲藥典》10.0[3-4]中替考拉寧有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，一維液相色譜圖見圖2，結(jié)合藥典中替考拉寧相對(duì)保留時(shí)間，其中A3-1色譜峰保留時(shí)間為8.93 min，A2-1a色譜峰保留時(shí)間為17.77 min，A2-1b色譜峰保留時(shí)間為18.43 min，A2-1色譜峰保留時(shí)間為19.56 min，A2-2色譜峰保留時(shí)間為20.95 min，A2-3色譜峰保留時(shí)間為21.51 min，A2-4色譜峰保留時(shí)間為23.59 min，A2-5色譜峰保留時(shí)間為24.06 min，雜質(zhì)1色譜峰保留時(shí)間為11.95 min，含量為1.61%，雜質(zhì)2色譜峰保留時(shí)間為21.85 min，含量為0.65%。

2.2 二維色譜一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果

根據(jù)一維液相色譜圖，分別對(duì)各目標(biāo)峰進(jìn)行中心切割，切換至二維液相中脫鹽處理，再進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)各峰精確質(zhì)荷比及同位素分布，推測(cè)其分子式，替考拉寧主成分及2個(gè)雜質(zhì)一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果分析見表2。

2.3 二維色譜二級(jí)質(zhì)譜主成分裂解途徑推導(dǎo)

替考拉寧主化學(xué)結(jié)構(gòu)由七肽組成的苷元母核、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖、氨基葡萄糖及其側(cè)鏈組成，其主成分結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜中容易脫甘露糖、N-乙酰基葡萄糖、氨基葡萄糖及其側(cè)鏈、脫氨產(chǎn)生相應(yīng)的m/z，同時(shí)脫去的糖基易在質(zhì)譜中脫水產(chǎn)生相應(yīng)的m/z。如 [MA2-2+H]+ m/z為1878.5643；[MA2-2-C5H6N2O4+H]+ m/z為1720.4591（推測(cè)結(jié)構(gòu)如圖5）；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈+H]+ m/z為1563.3643；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈-甘露糖+H]+ m/z為1401.3124；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈-甘露糖- N-乙酰基葡萄糖+H]+ m/z為1198.2306；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈-甘露糖- N-乙酰基葡萄糖-氨基]+ m/z為1181.1993；[M氨基葡萄糖氨及側(cè)鏈]+ m/z為316.2131；[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-H2O]+ m/z為298.2033；[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-2H2O]+ m/z為280.1939；298.2033離子烯醇式結(jié)構(gòu)互變?yōu)橥浇Y(jié)構(gòu)m/z為250.1809；[MN-乙酰基葡萄糖]+ m/z為204.0863；[MN-乙酰基葡萄糖- H2O]+ m/z為186.0754；[MN-乙酰基葡萄糖- 2H2O]+ m/z為168.0680；[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙酰基-H2O]+ m/z為144.0658；[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙酰基-2H2O]+ m/z為126.0570。 [MA3-1+H]+ m/z為1563.3555；[MA3-1-甘露糖+H]+ m/z為1401.3124；[MA3-1-甘露糖- N-乙酰基+H]+ m/z為1360.2847；[MA3-1-甘露糖- N-乙酰基葡萄糖+H]+ m/z為1198.2306；[MA3-1-甘露糖- N-乙酰基葡萄糖-氨基]+ m/z為1181.1993；[MN-乙酰氨基葡萄糖]+ m/z為204.0863；[MN-乙酰基葡萄糖- H2O]+ m/z為186.0754；[MN-乙酰基葡萄糖-2H2O]+ m/z為168.0680；[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙酰基-H2O]+ m/z為144.0658；[MN-乙酰基葡萄糖-N-胰腺基-2H2O]+ m/z為126.0570。A2-2二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3，A3-1二級(jí)質(zhì)譜圖見圖4，A2-2裂解方式見圖5。

2.4 雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)推導(dǎo)

雜質(zhì)1[M+H]+ m/z為1360.2847，推測(cè)分子式為C64H55Cl2N7O23，雜質(zhì)1二級(jí)質(zhì)譜圖見圖6，從圖中可知雜質(zhì)1主要碎片離子包括m/z 1360.2847， m/z 1198.2306， m/z 1181.1993， m/z 1153.2052，未發(fā)現(xiàn)N-乙酰基葡萄糖、氨基葡萄糖及其側(cè)鏈的質(zhì)譜信號(hào)，其與主成分A3-1的主要碎片離子基本相同，推測(cè)為A3-1結(jié)構(gòu)脫N-乙酰基葡萄糖所產(chǎn)生。其裂解方式為丟失甘露糖產(chǎn)生m/z 1198.2306 的子離子[M雜質(zhì)1-甘露糖+H]+ ；丟失甘露糖和氨基產(chǎn)生 m/z 1181.1993的子離子[M雜質(zhì)1-甘露糖-氨基]+；丟失甘露糖和乙酰基產(chǎn)生m/z 1153.2052的子離子 [M雜質(zhì)1-甘露糖-乙酰基]+。推測(cè)雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)如圖7。

2.5 雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)推導(dǎo)

雜質(zhì)2[M+H]+ m/z為1716.5077，推測(cè)分子式為C82H87Cl2N9O28，雜質(zhì)2二級(jí)質(zhì)譜圖見圖8，從圖中可知雜質(zhì)2主要碎片離子m/z有1716.5077， 1560.4125， 1401.3087， 1198.2231， 1181.2057， 316.2115， 298.2014， 280.1917， 250.1782， 204.0830， 186.0775， 168.0643， 144.0668， 126.0530，其與主成分A2-2或A2-3碎片離子m/z基本相同，推測(cè)可能是A2-2或A2-3脫甘露糖所產(chǎn)生。其裂解方式為丟失葡萄糖氨側(cè)鏈產(chǎn)生m/z 1560.4125的子離子[M雜質(zhì)2-葡萄糖氨側(cè)鏈+H]+；丟失葡萄糖氨及側(cè)鏈產(chǎn)生m/z 1401.3087的子離子 [M雜質(zhì)2-葡萄糖氨及側(cè)鏈+H]+；丟失葡萄糖氨及側(cè)鏈和N-乙酰基葡萄糖產(chǎn)生m/z 1198.2231的子離子 [M雜質(zhì)2-葡萄糖氨及側(cè)鏈- N-乙酰基葡萄糖+H]+；丟失葡萄糖氨及側(cè)鏈、N-乙酰基葡萄糖和氨基產(chǎn)生m/z 1181.2057的子離子 [M雜質(zhì)2-葡萄糖氨及側(cè)鏈- N-乙酰基葡萄糖-氨基]+；子離子[M氨基葡萄糖氨及側(cè)鏈]+ m/z為316.2115；子離子[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-H2O]+ m/z為298.2014；子離子[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-2H2O]+ m/z為280.1917；298.2014離子烯醇式結(jié)構(gòu)互變?yōu)橥浇Y(jié)構(gòu)m/z為250.1782；子離子[MN-乙酰基葡萄糖]+ m/z為204.0830；子離子[MN-乙酰基葡萄糖- H2O]+ m/z為186.0775；子離子[MN-乙酰基葡萄糖- 2H2O]+ m/z為168.0643；子離子[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙酰基-H2O]+ m/z為144.0668；子離子[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙酰基-2H2O]+ m/z為126.0530。推測(cè)雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)如圖9。

2.6 討論

本研究建立了一種二維在線超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定替考拉寧中未知雜質(zhì)的方法，一維液相采用藥典方法，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間對(duì)替考拉寧各組分進(jìn)行了確認(rèn)；二維液相與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，一級(jí)質(zhì)譜確認(rèn)各組分及雜質(zhì)的精確質(zhì)荷比，推測(cè)其分子式；二級(jí)質(zhì)譜采集各組分及雜質(zhì)的碎片離子，對(duì)主成分A2-2及A3-1的二級(jí)碎片離子進(jìn)行了歸屬，根據(jù)主成分裂解規(guī)律，推導(dǎo)了兩個(gè)雜質(zhì)的裂解方式，并推測(cè)了兩個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Tengattin等[7]經(jīng)研究，替考拉寧組分A2-2可以水解脫氨基葡萄糖及其側(cè)鏈產(chǎn)生A3-1，則A3-1可以進(jìn)一步水解脫N-乙酰氨基葡萄糖而產(chǎn)生雜質(zhì)1；替考拉寧的葡萄糖胺發(fā)生脂肪酰基化，疏水酰基鏈改變了替考拉寧的活性，疏水酰基鏈的長(zhǎng)短、支鏈的取代基及不飽和碳鍵造成了替考拉寧各組分之間的差異，疏水酰基鏈組成相同時(shí)，支鏈越多，該化合物在反相色譜的保留時(shí)間越弱。雜質(zhì)2的碎片離子與主成分A2-2和A2-3脫去甘露糖后的碎片離子一致，根據(jù)替考拉寧支鏈越多，反相色譜保留時(shí)間保留越弱原理，雜質(zhì)2為主成分A2-2脫甘露糖降解物。

3 結(jié)論

替考拉寧是發(fā)酵藥物，主要結(jié)構(gòu)組分有5個(gè)，雜質(zhì)較多，雜質(zhì)制備進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)其成分及雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，但一維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用由于質(zhì)譜檢測(cè)器的特殊性，必須采用揮發(fā)性鹽或酸作為流動(dòng)相，流動(dòng)相改變后原液相方法的色譜峰很難在質(zhì)譜方法中進(jìn)行定位，甚至色譜峰的出峰順序會(huì)改變，而且由于易揮發(fā)性鹽或酸種類有限，一維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的色譜方法分離度很難達(dá)到原液相方法的要求。本研究采用在線二維超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，一維液相采用藥典方法，二維液相采用適合質(zhì)譜的流動(dòng)相進(jìn)行脫鹽，脫鹽后直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。一維液相可以根據(jù)藥典中色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間確定主成分及雜質(zhì)出峰時(shí)間，二維液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜同時(shí)采集，一級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)荷比可以推測(cè)主成分及雜質(zhì)分子式；二級(jí)質(zhì)譜碎片離子可以對(duì)裂解方式進(jìn)行推導(dǎo)，推測(cè)未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。此方法簡(jiǎn)便、靈敏，可以快速地對(duì)替考拉寧未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，很好地解決了雜質(zhì)難以制備進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，為難以制備的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定提供了一種解決思路。

致謝：感謝沃特世科技（上海）有限公司應(yīng)用工程師楊青老師在實(shí)驗(yàn)和解譜上的應(yīng)用支持！

參 考 文 獻(xiàn)

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