短期抗生素暴露對氧化偶氮甲烷誘導小鼠結直腸癌前病變相關指征變化的影響

林嘉玲?何夏夢?蒲芳芳?蒙婷?商正云?胡雯?曾獻春

摘要：目的 探討短期抗生素暴露對氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）誘導小鼠結直腸癌前病變相關指征變化的影響。方法 40只3～4周齡SPF級雄性ICR小鼠隨機分為4組（10只/組）：對照組（Control組）、AOM干預組（AOM組）、抗生素+AOM干預組（Antibiotics+Azoxymethane，AbxAOM組）以及抗生素組（Antibiotics，Abx組）。AbxAOM組和Abx組灌胃抗生素溶液（氨芐西林100 mg/kg+新霉素100 mg/kg+甲硝唑100 mg/kg+萬古霉素50 mg/kg+兩性霉素B 1 mg/kg），Control組和AOM組灌胃等體積純水，2次/天，連續14 d。灌胃結束后，AOM組和AbxAOM組腹腔注射AOM溶液（10 mg/kg·bw），Control組和Abx組腹腔注射相應體積的無菌0.9% NaCl溶液，1次/周，連續4周。HE染色觀察小鼠結直腸組織病理學改變；RT-qPCR法檢測結直腸組織中VCAM-1、ICAM-1、Ki-67、IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF-A、TLR4、MyD88、NF-κB p65及COX-2的mRNA表達水平；免疫組化法觀察結直腸組織中Ki-67、NF-κB p65蛋白表達。結果 與Control組相比，AOM組小鼠結腸病理組織學評分顯著升高（P＜0.01），IL-6、TLR4、NF-κB p65及COX-2的mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。與AOM組比較，AbxAOM組異常隱窩灶（Aberrant crypt foci， ACF）數量增多（P＜0.05），ICAM-1、IL-1β、NF-κB p65的mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。結論 AOM處理可導致結腸病理損傷及ACF形成，可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活有關。抗生素暴露在短期內有加劇AOM所致結腸損傷和TLR4/MyD88/NF-κB信號通路進一步激活的趨勢，但此變化趨勢還需在長期實驗基礎上進一步探討。

關鍵詞：結直腸癌；抗生素；氧化偶氮甲烷

中圖分類號：R965文獻標志碼：A

Effects of short-term antibiotic exposure on changes in indicators related to azomethane-induced colorectal precancerous lesions in mice

Lin Jia-ling1， He Xia-meng2， Pu Fang-fang2， Meng Ting2， Shang Zheng-yun3， Hu Wen2， and Zeng Xian-chun1

（1 School of Laboratory Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500; 2 West China Hospital， Sichuan University， Chengdu? 610041; 3 West China School of Public Health， Sichuan University， Chengdu 610041）

Abstract? ? Objective To investigate the effect of short-term antibiotic exposure on the changes of azoxymethane （AOM）-induced colorectal precancerous lesions in mice. Methods Forty 3- to 4-week-old SPF-grade male ICR mice were randomly divided into four groups （10 mice/group）： Control group （Control group）， AOM intervention group （AOM group）， antibiotic+AOM intervention group （Antibiotics+Azoxymethane， AbxAOM group）， and antibiotic group （Antibiotics， Abx group）. The AbxAOM group and the Abx group were administered with antibiotic solution （ampicillin 100 mg/kg+neomycin 100 mg/kg+metronidazole 100 mg/kg+vancomycin 50 mg/kg +amphotericin B 1 mg/kg）， The control group and the AOM group was given an equal volume of pure water， twice a day， for 14 consecutive days. After gavage， the AOM group and the AbxAOM group were intraperitoneally injected with AOM solution （10 mg/kg.bw）， and the control group and the Abx group were intraperitoneally injected with the corresponding volume of sterile 0.9% NaCl solution， once a week for 4 consecutive weeks. HE staining was used to observe the pathological changes of colorectal tissue in mice. The expression of VCAM-1， ICAM-1， Ki-67， IL-1β， IL-6， TNF-α， VEGF-A， TLR4， MyD88， NF-κB p65， and COX-2 mRNA and the expression of Ki-67 and NF-κB p65 protein in colorectal tissues were detected by RT-qPCR and immunohistochemistry， respectively. Results Compared with the control group， mice in the AOM group had significantly higher colonic pathological histological scores （P＜0.01） and significantly higher mRNA expression of IL-6， TLR4， NF-κB p65， and COX-2 （P＜0.05）. Compared with the AOM group， the number of ACF was increased in the AbxAOM group （P＜0.05）， and the expression of mRNA for ICAM-1， IL-1β， and NF-κB p65 was significantly higher （P＜0.05）. Conclusion AOM treatment leads to colon pathological damage and ACF formation， which may be related to the activation of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Antibiotic exposure tends to aggravate AOM-induced colon damage and further activate TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in the short term. However， this trend needs to be further explored on the basis of long-term experiments.

Key words Colorectal cancer; Antibiotics; Azoxymethane

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球常見腫瘤之一。WHO報道每年CRC發病人數超過百萬，死亡人數超過50萬[1]。2020年，中國CRC新發病例56萬，在惡性腫瘤中發病率位居第二[2]。CRC的病因復雜多樣，主要包括遺傳背景因素和環境危險因素[3]。近年來，大量證據提示，抗生素暴露可以損傷腸黏膜、造成毒性影響和變態反應、刺激腸道收縮和蠕動、改變腸道微生態平衡等，進而引起腸道病變，與結直腸癌的患病風險存在關聯[4-9]。異常隱窩灶（aberrant crypt foci，ACF）是CRC癌前病變過程中最早期出現的病理結構，既往文獻認為，在腸道腫瘤進展期，ACF數量隨組織學改變的嚴重性增加，并且ACF可作為CRC的獨立預測因素[10-13]。此外，一些重要的炎性因子（如白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等）和炎癥通路（NF-κB信號通路）被認為是促進腫瘤發生的關鍵因素，會加速大腸癌的發展，尤其是結腸炎相關CRC[14-17]。但不同種類、劑量或時間的抗生素暴露和受試對象自身差異等因素，可能導致不同的研究結論。因此，需要進一步探索抗生素暴露對結直腸癌前病變相關指征變化的影響。本研究目的旨在研究短期抗生素暴露對氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）誘導小鼠CRC癌前病變相關指征變化的影響，并探索其可能的作用機制是否與NF-κB信號通路的激活有關。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠，SPF級，雄性，3～4周齡，40只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，并飼養于四川大學華西公共衛生學院分析測試中心，動物中心許可證號：SYXK（川）2018-209。飼養溫度設定在23～25℃范圍，濕度設定在40%～70%范圍，晝夜明暗交替周期設定為12 h，飼以SPF級大小鼠維持飼料并自由飲水，飼料和飲水均經無菌處理，正式試驗開始前適應性飼養7 d。

1.2 主要試劑與液體的制備

AOM購自Sigma-Aldrich公司，用無菌0.9% NaCl溶液配制，使AOM溶液終濃度為1 mg/mL。

根據參考文獻[18-20]報道的抗生素聯用方案，確定本研究抗生素種類及劑量方案為：氨芐西林100 mg/kg? （Cas： 7177-48-2）、新霉素100 mg/kg（Cas： 1405-10-3）、甲硝唑100 mg/kg（Cas： 443-48-1）、萬古霉素50 mg/kg （Cas： 1404-93-9）和兩性霉素B 1 mg/kg（Cas： 1397-89-3）。以上抗生素均購自大連美侖生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理

本實驗選取40只雄性ICR小鼠作為實驗對象，在實驗初始階段，采用隨機數字表法將所有小鼠隨機等分為4組，每組10只，分別為：對照組（control組）、AOM干預組（AOM組）、抗生素+AOM干預組（antibiotics+azoxymethane，AbxAOM組）以及抗生素組（antibiotics，Abx組）。各組處理措施如下：AbxAOM組和Abx組灌胃含廣譜抗生素的純水溶液，control組、AOM組則灌胃相應體積的純水，每天2次，連續14 d。灌胃結束后，AOM組和AbxAOM組腹腔注射AOM溶液（10 mg/kg·bw），control組和Abx組則腹腔注射相應體積的無菌0.9% NaCl溶液，每周1次，連續4周。干預期間，每天監測小鼠生長狀況及精神狀態，每周測量并記錄1次小鼠體重變化，并于處死前1天再進行1次體重稱量及糞便采集。實驗第11周，處死所有小鼠，采集1 cm結腸組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，以備后續病理及免疫組化檢測；剩余結腸組織則立即轉于-80℃保存，以備后續RT-qPCR檢測。

1.3.2 ACF的識別與計數

取多聚甲醛固定后的結腸組織約1 cm，在顯微鏡下（40～100）觀察并計數各病灶的ACF總數。ACF具有以下形態學特征：①隱窩較正常黏膜增大、增高；②隱窩周圍間隙增大、管腔不規則[21]。ACF發生率=發生ACF動物數/實驗動物數×100%。

1.3.3 結直腸組織蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）

將結直腸組織置于4%多聚甲醛（W/V）溶液中固定48 h后，石蠟包埋、切片，隨后行常規HE染色，封片后于光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇合格的3處視野，根據參考文獻[22]標準進行病理組織學評分。

1.3.4 結直腸組織RNA提取與RT-qPCR分析

嚴格按照試劑盒（動物組織總RNA提取試劑盒，成都福際生物科技有限公司）說明書步驟提取RNA。隨后，使用逆轉錄試劑盒（iscript cDNA Synthesis Kit，Bio-rad）從總RNA合成互補DNA。根據NCBI基因數據庫提供的基因序列，通過Primer 5軟件自行設計本研究所需目的基因和內參的基因序列，退火溫度均設置為60℃，如表1所示。采用反轉錄-定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法檢測小鼠結直腸組織核因子-κB p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65）、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、IL-6、Ki-67、Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）、TNF-α、細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）及血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的mRNA。RT-qPCR反應嚴格遵照試劑盒（SsoFast EvaGreen? Supermix，Bio-rad）說明書所示步驟進行。

1.3.5 免疫組化實驗

每組隨機挑選3只小鼠，采用免疫組化印跡（immunohistochemistry staining，IHC）檢測結直腸組織中Ki-67、NF-κB p65蛋白含量。使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，統一以像素面積pixel作為標準單位，分別測量每張切片中5個視野陽性的累積光密度值（IOD）以及對應的組織像素面積（Area），并計算出面密度=IOD/Area；分別測量每張照片中陽性細胞數以及對應的總細胞數，計算陽性率（%）=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.4 統計方法

數據統計分析均通過SPSS 26.0進行。不服從正態分布的資料，使用中位數和四分位數間距M（Q1～Q3）進行描述；定量資料條件若滿足正態性、方差齊，采取均數±標準差（x±s）的形式進行描述，多組獨立樣本則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用LSD法。定性資料或不滿足參數檢驗運用規則的定量資料，則采用非參數檢驗，若差異具有統計學意義，將各組原始數據轉換為秩次后，對秩次使用LSD法進行兩兩比較。病理組織學評分分析用Kruskal-Wallis秩和檢驗。按檢驗水準α=0.05，P＜0.05或P＜0.01則認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體重增長趨勢及生長情況

整個實驗過程中，AbxAOM組有3只小鼠意外死亡，分別發生在實驗第3、4周，AOM組有1只小鼠死亡，發生在實驗第3周，解剖未發現特殊病變或腫瘤。如圖1所示，在總體趨勢上，4組小鼠的體重均呈增加趨勢。組間比較差異無統計學意義。

2.2 小鼠結直腸組織病理組織學觀察、ACF及腫瘤發生情況

HE染色結果顯示：各組小鼠結直腸組織在肉眼及鏡下均未觀察到腫瘤形成，但有癌前病變ACF形成。AOM組中ACF發生率為11.11%，AbxAOM組中ACF發生率為28.57%，Abx組及Control組中無ACF形成。AOM組與AbxAOM組之間ACF發生率差異無統計學意義。此外，AbxAOM組的小鼠結直腸組織中ACF數量顯著高于AOM組（P＜0.01），如表2所示。

圖2所示，AOM組可見異常隱窩，腸黏膜腺體輕度異型性（可見腺腔增大），輕度不典型增生，可見腸黏膜不同程度炎細胞浸潤，與Control組相比，AOM組病理評分極顯著升高（P＜0.01）；AbxAOM組結直腸組織病理學改變與AOM組類似，兩者病理組織學評分不具有統計學差異。Control組和Abx組小鼠腸道病理損傷明顯減輕，結直腸組織少見或未見腸黏膜輕度炎細胞浸潤，上皮無明顯缺損，無隱窩萎縮，無ACF、腫瘤等改變。

2.3 AOM和抗生素干預對CRC小鼠結直腸組織相關基因mRNA表達的影響

小鼠結直腸組織相關炎癥因子基因的mRNA表達量如圖3A所示，與Control組相比，AOM組的IL-6 mRNA（P＜0.05）表達顯著升高；IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、VEGF-A mRNA呈升高趨勢。抗生素干預后，與AOM組相比，AbxAOM組IL-1β mRNA（P＜0.01）表達水平顯著增加；IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、VEGF-A mRNA表達呈升高趨勢。

小鼠結直腸組織NF-κB信號通路基因mRNA表達量如圖3B所示，與Control組相比，AOM組的TLR4 mRNA（P＜0.05）、NF-κB p65mRNA（P＜0.05）、COX-2 mRNA（P＜0.01）表達均顯著升高；MyD88 mRNA表達呈升高趨勢。抗生素干預后，與AOM組相比，AbxAOM組的NF-κB p65 mRNA（P＜0.05）表達水平顯著增加；TLR4 mRNA、MyD88 mRNA表達呈升高趨勢。

小鼠結直腸組織黏附分子基因的mRNA表達量如圖3C所示，與Control組相比，AOM組的VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA呈升高趨勢。抗生素干預后，與AOM組相比，AbxAOM組的ICAM-1 mRNA（P＜0.01）表達水平顯著增加；VCAM-1 mRNA表達呈升高趨勢。

小鼠結直腸組織增殖相關抗原基因的mRNA表達量如圖3D所示，與Control組相比，AOM組的Ki-67 mRNA呈升高趨勢。抗生素干預后，與AOM組相比，AbxAOM組的ki-67 mRNA表達呈升高趨勢。

2.4 AOM和抗生素干預對CRC小鼠NF-κB p65、Ki-67信號通路基因蛋白表達的影響

如圖4所示，與Control組相比，AOM組NF-κB p65蛋白表達呈上升趨勢；與AOM組相比，AbxAOM組NF-κB p65蛋白表達呈進一步增高趨勢，但差異均無統計學意義。Ki-67蛋白表達各組間差異無統計學意義。

3 討論

本實驗研究終點時未觀察到各組小鼠體重的組間差異，這或許受實驗時間所限。而腸道損傷是CRC進展過程中的重要環節，本研究結果顯示出AOM所致的結腸黏膜損傷，與Control組相比，AOM組病理評分顯著升高，可見ACF形成、腸黏膜腺體異型性（部分可見腸腔增大），以及輕度不典型增生，而ACF被認為是CRC發生發展過程中在光鏡下可觀察到的最早期、最小的腸黏膜上皮的癌前病變，與腺瘤、腺癌的發生密切相關[23]。有研究顯示，ACF的發生率以及數量在正常組、腺瘤組、CRC組呈逐步上升趨勢，CRC組ACF發生率高達95%[24]。本實驗研究結果顯示，AOM組、AbxAOM組均有ACF出現，與AOM組比，不論是ACF發生率還是均數，AbxAOM組均呈增長趨勢，提示短期抗生素暴露可能加速AOM誘導CRC癌前病變的發生發展。

先前研究揭示了微生物群在結直腸癌Toll樣受體（Toll-liked receptors，TLRs）依賴性識別中的作用[25]。一旦腸道屏障被微生物破壞，TLRs將識別這些微生物并誘導某些細胞因子的表達，最終激活免疫應答[26]。例如，革蘭陰性細菌脂多糖作用于TLR4使其活化后，在細胞質膜表面誘導MyD88的形成，并導致腸黏膜中NF-κB的激活，并誘導許多促炎因子（如細胞因子和黏附分子）的表達，從而放大炎癥級聯反應[27-28]。NF-κB的持續激活可以促進VEGF的轉錄表達，促進惡性腫瘤血管生成[29]。Wang等[30-31]發現，在大腸癌患者中，高水平的TLR4和MyD88與肝轉移風險增加和生存率降低相關。作為TLR4蛋白的下游因子，NF-κB是一種重要的調節因子，與炎癥和癌癥在多個水平上相關[32-33]。NF-κB p65在CRC組織中的過度表達與腫瘤分期增加和總生存率低相關[34-36]。COX-2是NF-κB的靶基因，COX-2在CRC中過表達，與CRC的發生有直接相關[37-40]。有研究顯示全身炎性細胞因子與TLR4通路關鍵蛋白（即TLR4、MyD88、NF-κB p65）表達呈正相關[41]。類似地，本研究發現TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，TNF-α、IL-6、IL-1β、VEGF-A、ICAM-1、VCAM-1在AOM處理后也有升高趨勢。抗生素處理后通路有進一步激活促炎因子和黏附分子有進一步升高的趨勢，提示短期抗生素暴露可能會加速AOM誘導CRC。

綜上所述，AOM引起結腸損傷，并導致ACF等癌前病變的產生，其部分機制可能為引起TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，并導致下游COX-2、炎癥因子、黏附分子以及增殖相關基因表達升高。而在短期內抗生素暴露有加劇AOM所致結腸損傷和進一步激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的可能。然而，腫瘤形成是長期、慢性、多因素影響的過程，本研究不足之處為樣本量較小、抗生素暴露時間較短，研究抗生素暴露對CRC發生發展的影響還需設計更長干預時間、更全面的實驗予以論證。

參 考 文 獻

Siegel R L， Miller K D， Goding Sauer A， et al. Colorectal cancer statistics， 2020[J]. CA Cancer J Clin， 2020， 70（3）： 145-164.

Sung H， Ferlay J， Siegel R L， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-249.

Gao R， Gao Z， Huang L， et al. Gut microbiota and colorectal cancer[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2017， 36（5）： 757-769.

Wang T T， Cai G C， Y P， et al. Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers[J]. ISME J， 2012， 6（2）： 320-329.

Lu S S M， Mohammed Z， H?ggstr?m C， et al. Antibiotics use and subsequent risk of colorectal cancer： A Swedish nationwide population-based study[J]. J Natl Cancer Inst， 2022， 114（1）： 38-46.

Zhang W， Zhu B， Xu J， et al. Bacteroides fragilis protects against antibiotic-associated diarrhea in rats by modulating intestinal defenses[J]. Front Immunol， 2018， 9： 1040.

Xue M， Ji X， Liang H， et al. The effect of fucoidan on intestinal flora and intestinal barrier function in rats with breast cancer[J]. Food Funct， 2018， 9（2）： 1214-1223.

陳思敏， 毛杰， 陳志茹， 等. 益生菌聯合水溶性膳食纖維對老年抗生素相關性腹瀉的防治效果[J]. 天津醫藥， 2018， 46（3）： 284-287.

Gianluca I， Herbert T， Antonio G. Antibiotics as deep modulators of gut microbiota： Between good and evil[J]. Gut， 2016， 65（11）： 1906-1915.

Cheng L， Lai M D. Aberrant crypt foci as microscopic precursors of colorectal cancer[J]. World J Gastroenterol， 2003， 9（12）： 2642.

Rudolph R E， Dominitz J A， Lampe J W， et al. Risk factors for colorectal cancer in relation to number and size of aberrant crypt foci in humans[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2005， 14（3）： 605-608.

Hurlstone D P， Karajeh M， Sanders D S， et al. Rectal aberrant crypt foci identified using high-magnification-chromoscopic colonoscopy： Biomarkers for flat and depressed neoplasia[J]. Am J Gastroenterol， 2005， 100（6）： 1283-1289.

Sakai E， Takahashi H， Kato S， et al. Investigation of the prevalence and number of aberrant crypt foci associated with human colorectal neoplasmACF and colorectal carcinogenesis[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2011， 20（9）： 1918-1924.

Merga Y J， O'Hara A， Burkitt M D， et al. Importance of the alternative NF-κB activation pathway in inflammation-associated gastrointestinal carcinogenesis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2016， 310（11）： G1081-G1090.

Landskron G， De la Fuente M， Thuwajit P， et al. Chronic inflammation and cytokines in the tumor microenvironment[J]. J Immunol Res， 2014： 149185.

Huang L C， Merchea A. Dysplasia and cancer in inflammatory bowel disease[J]. Surg Clin， 2017， 97（3）： 627-639.

Koliaraki V， Pasparakis M， Kollias G. IKKβ in intestinal mesenchymal cells promotes initiation of colitis-associated cancer[J]. J Exp Med， 2015， 212（13）： 2235-2251.

Ijssennagger N， Belzer C， Hooiveld G J， et al. Gut microbiota facilitates dietary heme-induced epithelial hyperproliferation by opening the mucus barrier in colon[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2015， 112（32）： 10038-10043.

Wong S H， Zhao L， Zhang X， et al. Gavage of fecal samples from patients with colorectal cancer promotes intestinal carcinogenesis in germ-free and conventional mice[J]. Gastroenterology， 2017， 153（6）： 1621-1633. e6.

Reikvam D H， Erofeev A， Sandvik A， et al. Depletion of murine intestinal microbiota： Effects on gut mucosa and epithelial gene expression[J]. PLoS One， 2011， 6（3）： e17996.

Xiao H， Hao X， Simi B， et al. Green tea polyphenols inhibit colorectal aberrant crypt foci （ACF） formation and prevent oncogenic changes in dysplastic ACF in azoxymethane-treated F344 rats[J]. Carcinogenesis， 2008， 29（1）： 113-119.

Meira L B， Bugni J M， Green S L， et al. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice[J]. J Clin Invest， 2008， 118（7）： 2516-2525.

Corpet D E， Tache S. Most Effective colon cancer chemopreventive agents in rats： A systematic review of aberrant crypt foci and tumor data， ranked by potency[J]. Nutr Cancer， 2002， 43（1）： 1-21.

Bouzourene H， Chaubert P， Seelentag W， et al. Aberrant crypt foci in patients with neoplastic and nonneoplastic colonic disease[J]. Hum Pathol， 1999， 30（1）： 66-71.

O'neill L A J， Golenbock D， Bowie A G. The history of Toll-like receptors-redefining innate immunity[J]. Nat Rev Immunol， 2013， 13（6）： 453-460.

Zou S， Fang L， Lee M H. Dysbiosis of gut microbiota in promoting the development of colorectal cancer[J]. Gastroenterol Rep （Oxf）， 2018， 6（1）： 1-12.

Kawai T， Akira S. Signaling to NF-κB by Toll-like receptors[J]. Trends Mol Med， 2007， 13（11）： 460-469.

Li Q， Withoff S， Verma I M. Inflammation-associated cancer： NF-κB is the lynchpin[J]. Trends Immunol， 2005， 26（6）： 318-325.

于錦超，于敏，莫煒.NF-κB信號通路在腫瘤發生和炎癥反應中的作用[J]. 藥物生物技術，2016， 23（1）： 82-85.

Wang A C， Su Q B，Wu F X， et al. Role of TLR4 for paclitaxel chemotherapy in human epithelial ovarian cancer cells[J]. Eur J Clin Invest， 2009， 39（2）： 157-164.

Wang E L， Qian Z R， Nakasono M， et al. High expression of Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88 signals correlates with poor prognosis in colorectal cancer[J]. Br J Cancer， 2010， 102（5）： 908-915.

Koji T， Michael K. NF-κB， inflammation， immunity and cancer： Coming of age[J]. Nat Rev Immunol， 2018， 18（5）： 309-324.

Didonato J A， Mercurio F， Karin M. NF‐κB and the link between inflammation and cancer[J]. Immunol Rev， 2012， 246（1）： 379-400.

Masayuki K， Takashi M， Nobuhiko S， et al. Increased nuclear factor-κB activation in human colorectal carcinoma and its correlation with tumor progression[J]. Anticancer Res， 2004， 24（2B）： 675-682.

Moorchung N， Kunwar S， Ahmed K. An evaluation of nuclear factor kappa B expression in colorectal carcinoma： An analysis of 50 cases[J]. J Cancer Res Ther， 2014， 10（3）： 631.

Berardi R， Maccaroni E， Mandolesi A， et al. Nuclear factor-κB predicts outcome in locally advanced rectal cancer patients receiving neoadjuvant radio-chemotherapy[J]. Dig Liver Dis， 2012， 44（7）： 617-622.

Schmedtje Jr J F， Ji Y S， Liu W L， et al. Hypoxia induces cyclooxygenase-2 via the NF-kappaB p65 transcription factor in human vascular endothelial cells[J]. J Biol Chem， 1997， 272（1）： 601-608.

Eberhart C E， Coffey R J， Radhika A， et al. Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas[J]. WB Saunders， 1994， 107（4）： 1183-1188.

Stern J， Miller G， Li X， et al. Virome and bacteriome： Two sides of the same coin[J]. Curr Opin Virol， 2019， 37： 37-43.

Jeong J W， Park C， Cha H J， et al. Cordycepin inhibits lipopolysaccharide-induced cell migration and invasion in human colorectal carcinoma HCT-116 cells through down-regulation of prostaglandin E2 receptor EP4[J]. BMB Rep， 2018， 51（10）： 532.

Ji C L， Deng Y S， Yang A C， et al. Rhubarb enema improved colon mucosal barrier injury in 5/6 nephrectomy rats may associate with gut microbiota modification[J]. Front Pharmacol， 2020， 11（29）： 1092.