高毒力肺炎克雷伯菌毒力特性及其對RAW264.7細胞炎癥反應的影響

畢建蝶?劉淑敏?何秋月?韓睿輝?杜艷

摘要：目的 對收集的肺炎克雷伯菌進行高毒力鑒定，探討其對鼠源巨噬細胞RAW264.7炎癥相關因子表達的影響。方法 收集臨床分離的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）疑似菌株，首先回顧性分析患者臨床情況，再結合拉絲試驗、PCR擴增毒力質粒相關基因和藥敏試驗鑒定其高毒力特性及耐藥情況。然后將細菌分別感染RAW264.7細胞4 h和24 h后，黏附與抗吞噬試驗檢測細菌免疫逃避能力，ELISA法檢測細胞培養上清中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達。結果 兩株臨床菌株均為高黏液表型、攜帶毒力質粒相關基因及患者病情嚴重復雜，判定為HVKP，并且出現了多重耐藥（Muiti-drug resistant，MDR）且對碳青霉烯類耐藥的HVKP（MDR-HVKP）。在感染4 h和24 h后，巨噬細胞胞外細菌黏附數及胞內活菌數都為：標準菌株>HVKP臨床>MDR-HVKP臨床，差異均有統計學意義。在感染4 h內TNF-α的表達水平顯著升高，而IL-6和IL-1β的表達水平均較低。與標準菌株相比，HVKP臨床（P=0.007）和MDR-HVKP臨床（P=0.009）更能增加TNF-α的表達水平。當感染達到24 h時，IL-6和IL-1β的表達水平上升較明顯，同樣高毒力菌株感染引起IL-6和IL-1β表達水平增加的程度大于標準菌株，差異均有統計學意義。結論 本研究的HVKP具有高黏液表型、攜帶毒力質粒相關基因及免疫逃避能力強的特性，易對免疫力低下的重癥患者造成嚴重感染。在感染鼠源巨噬細胞RAW264.7后，主要通過釋放促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β來加劇炎癥反應。

關鍵詞：高毒力肺炎克雷伯菌；多重耐藥；免疫逃避；炎癥因子

中圖分類號：R9，R517.6文獻標志碼：A

Virulence characteristics of hypervirulent Klebsiella pneumoniae and its effect on the inflammatory cytokine response of RAW264.7 cells

Bi Jian-die， Liu Shu-min， He Qiu-yue， Han Rui-hui， and Du Yan

（Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine， Yunnan Province Clinical Research Center for Laboratory Medicine， Kunming 650032）

Abstract Objective To identify the hypervirulence of collected Klebsiella pneumoniae and to explore the effect of Klebsiella pneumoniae on the expression of RAW264.7 inflammatory cytokines in mouse macrophages. Methods? ? The suspected strains of hypervirulent Klebsiella pneumoniae （HVKP） were collected. Firstly， the clinical situation of the patients was analyzed retrospectively， and then the high virulence characteristics and drug resistance were identified by the string test， PCR amplification of virulence plasmid related genes， and the drug sensitivity test. Then， the bacteria were infected with RAW264.7 cells for 4 h and 24 h， respectively. The immune escape ability of bacteria was detected by adhesion and anti-phagocytosis tests， and the expression of cytokines， TNF-α， IL-6， and IL-1β in the supernatant of cell culture was detected by ELISA. Results? ? The two clinical strains had hypermucoid phenotype， carried virulence plasmid related genes， and patients with serious and complicated conditions， identified as HVKP， and showed carbapenem resistance and multiple-drug resistance （MDR-HVKP）. At 4 h and 24 h after infection， the number of extracellular bacterial adhesion and intracellular viable bacteria of macrophages were as follows： standard strain > HVKP clinical > MDR-HVKP clinical， and the difference was statistically significant. Within 4 hours of infection， the expression of TNF-α was significantly increased， while the expression of IL-6 and IL-1β was low. Compared with the standard strains， the HVKP clinical （P=0.002） and MDR-HVKP clinical （P=0.009） strains could increase the expression level of TNF-α in clinic. When the infection reached 24 hours， the expression level of IL-6 and IL-1β increased significantly. The increase of IL-6 and IL-1β expression caused by the hypervirulent strain was higher than that of the standard strain， and the difference was statistically significant. Conclusion? ? The HVKP in this study has the characteristics of hypermucoid phenotype， virulent plasmid-related genes， and strong immune escape ability. It is easy to cause serious infection in critically ill patients with low immunity. After infection with mouse macrophage RAW264.7， the inflammatory response was aggravated mainly by releasing pro-inflammatory factors TNFα， IL-6， and IL-1β.

Key words Hypervirulent Klebsiella pneumoniae; Multidrug-resistant; Immune escape; Cytokines

肺炎克雷伯菌可引起多種感染，包括肺炎、尿路感染、菌血癥和肝膿腫等[1]，通常在免疫低下的人群中引起嚴重感染，但高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）的出現和傳播則擴大了易感人群，該菌既是醫院感染相關的原因也是社區獲得性感染的原因[2]。在臨床微生物學實驗室沒有對HVKP進行常規檢測且近年來碳青霉烯耐藥的HVKP、多粘菌素耐藥的HVKP和多重耐藥（muiti-drug resistant，MDR）的HVKP正在出現的情況下[3-5]，使得這類感染的治療非常具有挑戰性。巨噬細胞作為人體的主要效應細胞，通過識別、吞噬和殺死微生物，在宿主防御中起著基礎性的作用[6]。當機體被肺炎克雷伯菌感染后，大量中性粒細胞和巨噬細胞能夠募集至感染部位，導致促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的大量產生、釋放和激活增加[7-8]。目前HVKP菌株直接作用于免疫細胞方面的研究較少，其確切作用和相關機制仍有待進一步探索。為了進一步了解HVKP的臨床特征、毒力特點和耐藥性，并改善患者護理和預后，所以本研究將從患者臨床情況、分子水平和細胞水平對源于臨床的兩株HVKP疑似菌株進行鑒定及毒力特性分析，初步探討其對鼠源巨噬細胞RAW264.7炎癥相關因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞株來源

本研究應用的兩株肺炎克雷伯菌分離自昆明醫科大學第一附屬醫院的兩名重癥住院患者，經MALDI-TOF MS質譜儀進行鑒定。因兩位患者病情嚴重且檢出的肺炎克雷伯菌疑似HVKP，故納入本研究。肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC BAA-1706、鼠源巨噬細胞RAW264.7購自美國ATCC公司。

1.1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；革蘭陰性細菌藥敏卡（AST-GN16卡）購自法國BioMérieux公司；2×Taq PCR MasterMix購自北京博邁德生物公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自Biological Industries公司；TritonX-100購自Sigma Aldrich公司；慶大霉素液購自索萊寶公司；Mouse TNF-α、 IL-6、IL-1β ELISAKit 購自杭州聯科生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 患者臨床情況、拉絲試驗和PCR試驗相結合進行高毒力鑒定及藥敏試驗

臨床信息收集：菌株攜帶者的臨床信息利用LIS系統回顧性分析。

拉絲試驗檢測細菌高黏液表型：用接種環輕觸培養基上的單個菌落后向外拉，能夠形成≥5 mm的黏液絲判斷為拉絲試驗陽性[9]。

參照文獻[10]，PCR擴增毒力質粒相關基因（rmpA、rmpA2、HI1B、iroN、iutA）以判定毒力質粒的攜帶情況：使用基因組試劑盒進行菌株DNA提取，PCR反應采用25 μL反應體系：基因組DNA模板1 μL；Taq Master Mix 12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；上下游引物各1 μL，毒力基因引物序列及擴增片段長度見表1。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 cycles；72℃，5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，陽性產物送至北京博邁德生物公司測序，測序結果于NCBI網站進行BLAST比對。

藥敏試驗：VITEK-2 全自動細菌鑒定藥敏儀和AST-GN16藥敏卡測定美羅培南、亞胺培南、厄他培南、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢曲松、哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、四環素、環丙沙星、左氧氟沙星和復方磺胺甲惡唑的藥敏結果和ESBLs產生情況。ESBLs確證采用紙片擴散法克拉維酸抑制實驗：將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板上，分別將頭孢噻肟、頭孢他啶單藥及其與克拉維酸復合藥的藥敏紙片貼于平板上，任何一對藥物中復合藥的抑菌圈直徑大于單藥直徑5 mm即可確認為產ESBLs的肺炎克雷伯菌。藥敏結果判讀依據2020年CLSI M100 S30文件進行。

1.2.2 HVKP菌株與RAW264.7細胞共培養

（1）細菌黏附試驗

將培養至對數生長周期的細菌用PBS懸浮并利用細菌比濁儀調節菌懸液濃度為1×108 CFU/mL備用。將RAW264.7細胞以每孔1×105個細胞的密度接種到12孔板中37℃、5%CO2條件下培養12 h，于倒置顯微鏡下觀察約90%細胞貼壁生長后3組細菌按感染復數MOI=100：1比例與RAW264.7細胞分別共培養4 h和24 h，PBS洗滌3次，然后每孔加入200 ?L胰蛋白酶消化細胞，用800 ?L培養基終止消化。最后將1 mL細胞懸液稀釋合適倍數后（4 h稀釋10倍，24 h稀釋100倍）取10 ?L涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上進行培養以計數菌落。

（2）細菌抗吞噬試驗

如上所述進行細菌細胞共培養4 h和24 h后PBS洗滌3次，然后加入 DMEM-10%胎牛血清-慶大霉素（終濃度100 ?g/mL）500 ?L，并將反應混合物孵育1 h殺死細胞外細菌。無菌PBS再洗滌3次，加入200 ?L0.5%的Triton-X100，于37℃條件下裂解細胞5 min，加入800 ?L無菌PBS，吹打混勻后懸液（除標準菌株需稀釋2倍，其余均不稀釋）取10 ?L涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上進行培養以計數菌落。

（3）細胞因子檢測

如上所述進行細菌細胞共培養4 h和24 h后取細胞培養上清，4 ℃下10000 r/min離心10 min，參照聯科生物ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中的TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.2.3 統計學處理

每次試驗獨立重復3次，使用 SPSS 25. 0 軟件進行統計學分析。定量資料表示為均數±標準差（x±s），多組均值間采用單因素方差分析，方差齊用LSD 法進一步作多重比較；方差不齊則采用非參數秩和檢驗，P<0.05，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高毒力菌株的鑒定及藥敏結果

2.1.1 菌株攜帶患者情況

兩株菌分別分離于腫瘤和腦部疾病患者，兩位患者均有肺部感染且患有高血壓等基礎疾病，具體情況見表2。

2.1.2 兩株臨床菌株判定為高黏液型HVKP

與標準菌株相比，本研究中的兩株臨床分離株拉絲試驗陽性，具有高黏液表型，且PCR擴出毒力質粒相關基因rmpA、rmpA2、iroN、iutA 和質粒復制子相關基因HI1B，提示攜帶毒力質粒，如圖1～2。

2.1.3 兩株臨床HVKP菌株具有不同的抗生素敏感性

其中一株對檢測的16種抗生素均表現為敏感且ESBLs檢測為陰性，而另一株除了對碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南、厄他培南）耐藥，還對頭孢菌素類抗生素（頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢曲松）、青霉素類抗生素（哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸）、單環β-內酰胺酶類抗生素（氨曲南）及磺胺類抗生素（復方磺胺甲惡唑）耐藥，ESBLs確證實驗為陰性，表現出MDR。根據抗生素敏感性的差異將兩株菌標識為HVKP臨床和MDR-HVKP臨床繼續后續研究。

2.2 HVKP臨床株和MDR-HVKP臨床株的免疫逃避能力遠強于標準菌株

黏附試驗顯示：3株菌在RAW264.7細胞外的黏附數4 h和24 h都為標準菌株>HVKP臨床>MDR-HVKP臨床，

差異均有統計學意義。在抗吞噬試驗中，當這些菌株被RAW264.7吞噬時，觀察到類似的趨勢，如表3。只有少部分的HVKP臨床和MDR-HVKP臨床株被吞噬，提示高毒力菌株有較強的抗吞噬特性。

2.3 HVKP臨床株和MDR-HVKP臨床株感染能促進RAW264.7細胞促炎性細胞因子的表達

在感染4 h內，與標準菌株相比，TNF-α的表達水平在HVKP臨床（P=0.007）和MDR-HVKP臨床（P=0.009）感染后顯著升高。當感染到達24 h時，TNF-α表達的水平均升高較少，且整體趨勢和4h時相似。對于IL-6的表達水平，與標準菌株相比4h內在HVKP臨床（P=0.004）和MDR-HVKP臨床（P=0.124）感染后略微升高。當感染達到24 h時，IL-6的表達水平較4 h時明顯升高，整體趨勢與4 h時相似。IL-1β的表達水平在感染4 h內較低，在3株菌中均無顯著差異，但當感染達到24 h時，與標準菌株相比，HVKP臨床株（P<0.001）和MDR-HVKP臨床（P<0.001）株感染更能增加IL-1β的表達水平。本研究兩株HVKP在4 h、24 h誘導的IL-6、IL-8和TNF-α的產生均顯著高于標準菌株，如圖3。提示高毒力菌株在感染鼠源巨噬細胞RAW264.7細胞后，4 h內主要通過釋放促炎因子TNF-α引起更嚴重的炎癥反應，而4～24 h主要通過釋放IL-6和IL-1β來加劇炎癥反應。

3 討論

HVKP在社區和醫院獲得性肺炎患者中普遍存在[11]，特別會對免疫功能低下的人（糖尿病或惡性腫瘤患者）引起嚴重感染，如肺炎、菌血癥或腦膜炎，臨床進展迅速，最終預后不良[2]。本研究中兩株HVKP分離自腦部疾病和腫瘤患者，患者分別進行過侵入性操作和免疫治療，可能造成局部免疫力薄弱而更易誘發HVKP肺部感染[2]。早期的研究將高黏液表型作為HVKP菌株的定義特征，然而并非所有的HVKP菌株都具有高黏液表型，且一些CKP菌株也具有這一特征[12]，因此需要結合其他指標來進行判斷。HVKP毒株最具特征性的毒力因子是由毒力質粒上的莢膜調節基因（rmpA或rmpA2）、沙門菌素（iroBCDN）和氣桿菌素（iucABCD-iutA）鐵載體合成基因簇等編碼，這些基因在毒力過程中起著至關重要的作用，臨床上常用于檢測HVKP菌株[13]。本研究綜合考慮患者臨床情況、高黏液表型和毒力質粒的攜帶，將菌株鑒定為HVKP，對于警示臨床防治HVKP的暴發感染具有重要意義。

巨噬細胞對細菌有較強的吞噬殺傷作用，細菌的抗吞噬能力越強則證明毒力越強[14]。在本研究中，初步判定為HVKP的兩個臨床分離株抵抗巨噬細胞RAW264.7吞噬殺傷的能力明顯強于標準菌株，表明其擁有比標準菌株更強的毒力。已知莢膜在感染過程中對細菌具有多種保護作用，作為一種抗吞噬因子能夠阻止細菌與哺乳動物細胞的黏附[1]。rmpA或rmpA2協調莢膜和高黏液表型[15]，丟失可降低莢膜產量、黏液黏度和毒力[16]。本研究中兩株高黏液HVKP均攜帶rmpA和rmpA2基因，而在非高黏液的標準菌株中則沒有，說明rmpA和rmpA2是與高黏性相關的基因。據報道：與非高黏液分離株相比，高黏液肺炎克雷伯菌具有較低的黏附能力和較強的抗吞噬能力，但引起宿主細胞損傷和凋亡的程度較嚴重，高黏液表型能夠影響細菌與宿主細胞間的聯系[17-19]。高黏液表型似乎是免疫逃避更關鍵的決定因素。在本研究中高黏液型的兩株HVKP同樣具有黏附能力低而抗吞噬能力強的特性，與以上研究結果一致，提示高黏液HVKP菌株有較強的免疫逃避能力。另外推測肺炎克雷伯菌的快速黏附能夠促進細胞對其進行吞噬殺傷，因為巨噬細胞胞內吞噬的活菌數總是與胞外細菌黏附數成正比關系。盡管高黏液表型對HVKP很重要，但莢膜與高黏液表型之間的聯系仍在闡明中，高黏液表型并不一定依賴于莢膜合成[18]。高黏液表型也可能影響藥敏試驗，隨著MDR菌株的增加，這可能成為一個更常見的問題[13]。

病原體與宿主細胞的黏附是致病性的初始階段，而隨后進入宿主細胞，如果宿主細胞被病原體激活或者凋亡延遲，則會釋放大量自由基等有害物質會引起機體的過度炎癥反應，甚至遷延全身[20]。 TNF-α、IL-6、IL-1β是抗肺炎克雷伯菌感染的主要效應因子，Cheng等[17]用乳腺炎奶牛分離的兩株肺炎克雷伯菌感染牛微血管內皮細胞，結果顯示兩株菌均能促進IL-6、IL-1β和TNF-α產生，且高黏液分離株激發了更明顯的促炎反應。另一研究同樣顯示高黏液HVKP對視網膜色素上皮細胞的致炎性較非高黏液的經典的肺炎克雷伯菌更強[14]。在本研究中得到了同樣的趨勢，兩株具有高黏液表型的HVKP菌株在4 h和24 h都引起了更嚴重的炎癥反應。TNF-α是革蘭陰性菌急性炎癥反應的主要介質，出現在感染的最初幾個小時內，主要由激活的巨噬細胞產生然后刺激中性粒細胞和單核細胞募集到感染部位，并激活這些細胞以清除微生物[4]。在與TNF-α的聯合作用中，IL-1β被認為對自然免疫和炎癥起作用，它的產生可能是由細菌產物如脂多糖，以及其他細胞因子如TNF-α本身誘導的[21]。Friedrich等[22]的肺炎克雷伯菌小鼠膿毒癥模型中描述到感染病灶中IL-1β水平升高出現在TNF-α升高之后，特別是在細菌滴注72 h之后。然而，本研究結果顯示在高毒力菌株感染最初的4 h TNF-α基本達到最大釋放量，感染4 h之后到達24 h主要通過釋放IL-6和IL-1β來加劇炎癥反應，3種炎癥因子的釋放均出現較早，可能是感染模型與菌株毒力的不同造成的差異。

綜上所述，本研究分離的高毒力菌株具有高黏液表型、表達毒力質粒相關基因及免疫逃避能力強的特性，且感染鼠源巨噬細胞RAW264.7細胞后，可釋放促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β引起嚴重感染。雖然目前由于敏感性和特異性問題拉絲試驗作為高毒力篩查方法存在缺陷，但因操作簡單用于臨床初步篩查高毒力菌株還是非常具有參考意義的。必要時要充分考慮將患者臨床情況、菌株表型、毒力基因攜帶情況及免疫逃避能力等結合起來判斷菌株是否為HVKP，然后對分離的HVKP菌株及時給予高度關注并采取適當治療措施。本院的MDR-HVKP菌株很可能是由經典的MDR菌株獲得了一個毒力質粒進化而來，MDR-HVKP菌株具備經典多重耐藥菌株擁有的高耐藥性和高傳播能力，這應當引起相關科室的足夠重視。然而本研究標本源于臨床存在較多未知因素，量少不足以代表絕大多數HVKP，在進一步的研究中將進行全基因組測序完善菌株信息，以比較這兩個分離株的不同而在細胞水平做更加深入的機制研究。

參 考 文 獻

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