施氮水平對花生根際土壤微生物群落結構和多樣性的影響

梁滿 孟維偉 陳志德 沈一 劉永惠 沈悅 劉柱 南鎮武 徐杰 張正

摘要：本試驗通過16S rRNA基因測序技術，研究零氮（0 kg/hm2）、低氮（75 kg/hm2）、中氮（150 kg/hm2）和高氮（225 kg/hm2）4個氮肥梯度對花生根際土壤微生物群落組成和結構的影響。結果表明，施氮可以提高花生根際土壤微生物群落的豐富度和多樣性，不同氮肥處理中以中氮處理的Chao 1指數和Shannon指數最高。施氮處理下的OTUs個數均多于不施氨，且隨著氮肥施人量的增加呈先升高后降低的趨勢，中氮處理較零氮、低氮和高氨分別高11.21%、4.90%和7.01%。不施氮和在一定施氮范圍內，土壤微生物群落穩定，但是高氮會導致土壤微生物群落不穩定。16S rRNA功能預測分析顯示，施氮處理下的細胞運動等功能基因的豐度相對升高，對花生根際土壤微生物群落的功能豐度譜產生一定的影響。本研究明確了施氮對花生根際土壤微生物群落結構和多樣性的影響，為深入研究不同施肥措施對花生根際微生態的影響提供了借鑒。

關鍵詞：花生根際；施氨水平；土壤微生物群落功能多樣性；16S rRNA

中圖分類號：S565.2：S154.34 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0078-06

花生是我國重要的油料作物，也是重要的植物油脂和蛋白質來源。氮是花生吸收量最大的營養元素，增施氮肥能提高花生產量、改善花生品質。此外，地下部微生物群落也受到氮肥的影響。土壤氮水平是影響根際微生物的重要因素，對土壤微生物群落結構和多樣性有一定的影響。研究發現，氮肥的施用可以提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落的豐富度和功能多樣性。付智丹等發現適宜的施氮量不僅能夠增加玉米、大豆套作土壤中的真菌、放線菌和固氮菌的數量，還能調節土壤氮素的轉化。趙帆等發現微生物群落結構受多種土壤環境因子的影響，以土壤全氮含量和pH值對微生物群落的影響最顯著。丁紅等發現在于旱低氮雙重脅迫下，花生根際細菌可能在花生生長和響應逆境脅迫中起重要作用。然而，目前關于氮肥用量和微生物類群之間的關系仍未明確，不同施氮量對花生土壤微生物群落的影響還缺乏系統研究。

本試驗探究不同施氮水平對花生根際土壤微生物群落組成和結構的影響，預測細菌群落功能，以期為花生建立合理的施肥制度和提高氮肥利用率提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗地概況與試驗材料

試驗于2018年在山東省農業科學院濟陽試驗基地進行，土壤類型為潮土，質地沙壤，0-20cm土層有機質含量為12.3g/kg，全氮0.5 g/kg，堿解氮52.8 mg/kg，速效磷93.1 mg／kg，速效鉀10.2 mg/kg，鹽分0.21％，pH 7.3。

供試花生品種為花育25號，壟作種植，壟底寬80 cm，壟面寬40 cm，壟上播2行花生，行距35cm，穴距18 cm，每穴2株。

1.2試驗設計

試驗設4個處理：NO（零氮，0 kg/hm2）、Nl（低氮，75 kg/hm2）、N2（中氮，150 kg/hm2）、N3（高氮，225 kg/hm2）。3次重復。磷肥為P2O5120 kg/hm2、鉀肥為K2O 120 kg/hm2，均作底肥一次性施入。

1.3根際土壤采集

于花生結莢期將整株挖出，抖落根系表層土壤，用滅菌刷子將根際1～10 mm的土壤拂刷下來放入無菌袋中，同一處理的花生根際土壤樣品混合成一個土壤樣品，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。相關測試由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.4測定方法

根據OMEGA Soil DNA Kit試劑盒（USA）說明書進行土壤微生物總DNA的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀分析檢測DNA的濃度和純度。以提取的土壤樣本DNA為模板，對土壤細菌16SrRNA基因進行擴增，引物為V3-V4區的343F（5-TACGGRAGGCAGCAG -3'）以及798R（5-AGGGTAT CTAATCCT-3'）。PCR擴增體系（20uL）：預混液10 uL，正、反向引物（10 umol/L）各0.8 uL，DNA模板（10 ng）1 uL，ddH2O補足至20uL。擴增程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環：72℃ 10 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，UnionCity，USA）進行純化，利用QuantiFluorTM -ST（Promega，USA）進行定量和Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。

1.5生物信息學分析

采用Alpha多樣性分析方法，對樣本間的主成分進行分析（PCA），以挖掘花生根際土壤細菌群落組成的差異?；贕reengenes數據庫注釋的16S rRNA測序數據，使用PICRUSt軟件預測已知微生物基因功能的構成，從而統計不同樣本和分組之間在功能上的差異。

2結果與分析

2.1土壤微生物群落豐富度和多樣性變化

由表1可以看出，各處理間覆蓋度無顯著差異，平均值均在0.95以上，土壤樣本文庫覆蓋率較高。施氮處理下的Observed species指數和Chao 1指數均高于不施氮處理，且均隨氮肥施入量的增加呈先升高后降低的趨勢，其中N1和N2的Observed species指數差異不顯著，但顯著高于NO和N3，Chao 1指數以N2處理最高。Shannon指數隨著施氮量的增加先增加后減少，在N2處理達到最大值；施氮處理下的Simpson指數差異不顯著，但均低于不施氮處理，說明施氮處理群落物種分配不均勻，多樣性高。表明施氮可以提高花生根際微生物群落的豐富度和多樣性，不同施氮水平以N2處理最優。

2.2土壤微生物群落組成分析

圖1可見，在門分類水平上，各處理中根際土壤細菌群落排名前5位的優勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria，41.41％～47.50％）、放線菌門（Actinobacteria，15.76％-16.80％）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，12.34％～15.04％）、擬桿菌門（Bacteroidetes，11.81％-15.38％）和厚壁菌門（Firmicutes，4.87％-5.18％）。在優勢菌門中，施氮處理下的變形菌門和放線菌門的相對豐度均高于不施氮處理，其中變形菌門相對豐度以N2處理最高，放線菌門的相對豐度在N1和N2處理下差異不顯著，但均高于N3處理，說明花生根際土壤微生物群落的優勢菌門相對豐度并沒有隨著施氮量的增加而一直增多。施氮量對其它3種優勢菌群（芽單胞菌門、擬桿菌門和厚壁菌門）的相對豐度影響不大。

2.3土壤微生物群落OTUs聚類分析

如圖2所示，所有處理中共有的OTUs為1 385。在97％的相似度下，NO、N1、N2、N3各處理分別平均獲得2 445、2 592、2 719、2 541個OTUs，3種施氮處理下的OTUs數均多于不施氮，且隨著氮肥施人量的增加呈先升高后降低的趨勢．其中N2處理較NO、N1和N3高11.21％、4.90％和7.01％。表明，施氮可以提高花生根際微生物群落的OTUs數。

2.4土壤微生物群落主成分分析

如圖3所示，橫坐標（PCl）能夠解釋12.6％的樣本差異，縱坐標（PC2）能夠解釋11.4％的樣本差異。聚類分析表明，同一處理3次重復聚集到同一分支，不同處理樣本間距離較遠，差異較大，聚集于不同分支。PC1將NO和N1與N2和N3明顯區分，NO處理全部分布在PC1的負方向，N2和N3處理分布在PC1的正方向，而N1處理在PC1正負方向上均有分布。PC2將N3處理與NO、N1和N2明顯區分，N3處理全部分布在PC2的負端，NO、N1和N2處理主要出現在PC2的正端。說明施氮影響了花生根際土壤環境，使根際土壤細菌群落多樣性產生較大差異。從圖3還可以看出，NO、N1和N2處理得分系數離散小，N3處理得分系數變異較大，這一研究結果表明，不施氮和在一定施氮范圍內，土壤微生物群落穩定，但是過量施入氮肥會導致土壤微生物群落不穩定。

2.5土壤微生物群落潛在功能預測

如圖4所示，氨基酸轉運和代謝（amino acid transport and metabolism）、轉錄（transcription）、信號傳導（signal transduction mechanisms）、細胞壁／膜／包膜生物發育（cell wall/membrane/envelope biogenesis）、能量生產與轉化（energy production and conversion）和碳水化合物轉運和代謝（carbo-hydrate transpon and metabolism）這6類功能所占的比重較大。與不施氮相比，施氮處理下的細胞運動（cell motility）、細胞骨架（cytoskeleton）和細胞內運輸、分泌和囊泡運輸（intracellular trafficking，secretion，and vesicular transport）等功能基因的豐度相對升高，說明花生根際土壤細菌群落在適量氮素的調控下會產生較高的活性。

3討論

根際是植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的微生態環境，在植物生長和發育過程中起著重要作用，根際微生物作為根際的重要組成部分，其群落多樣性反映群落總體的動態變化?？茖W的肥料管理通過影響土壤微生物量和菌群結構，從而在一定程度上改變土壤養分和作物產量。本研究顯示，施氮可以提高花生根際微生物群落的豐富度和多樣性，其中150kg/hm2氮肥施用量的Chao 1指數和Shannon指數最高。聶江文等研究湖南雙季稻區微生物群落發現，在冬種紫云英不還田條件下配施氮肥處理的多樣性指數以及物種豐富度指數均高于不施氮。謝文軍、覃瀟敏等發現，施用無機化肥可以提高土壤微生物的Shannon指數。說明土壤氮水平對土壤微生物的多樣性和群落結構有一定的影響，本研究發現中氮處理下的土壤微生物活性最佳，高氮處理對微生物的活性產生抑制作用。

秸稈還田及配施氮肥條件下，水稻田根際土壤中優勢菌門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等，干旱脅迫和低氮處理下花生根際土壤中的變形菌門相對豐度降低。本研究中，各根際土壤細菌群落的處理中排名前5位的優勢菌門分屬變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，其中，變形菌門相對豐度以中氮處理最高，說明變形菌門在低氮條件下的相對豐度較低，這與丁紅等的研究結果一致。施肥對土壤微生物群落的影響存在一定的不確定性，白震等發現不同配施會抑制黑土中大多數菌群的生長，但在氮肥優化條件下，能提高微生物的菌群含量。本研究發現，施氮影響了花生根際土壤環境，使根際土壤細菌群落多樣性產生較大差異，過量施人氮肥會導致土壤微生物群落不穩定，可能是在含氮較高的土壤中，花生結瘤固氮量少，固氮細菌群落的生長受到抑制。16S rRNA功能預測表明施氮對花生根際土壤微生物群落的功能豐度譜產生一定的影響，施氮處理下的細胞運動等功能基因的豐度相對升高，可能與土壤環境的變化導致花生根際土壤細菌代謝發生改變有關。氮肥對土壤中微生物的影響也與土壤的環境因素和作物管理等條件有關，施氨水平對花生根際微生物群落結構和多樣性的影響還需要進一步深入研究和驗證。因此，今后還應深入研究不同施肥措施對花生根際微生態的影響，探討根系發育與土壤微生物群落結構和多樣性的關系，以期為花生建立合理的施肥制度和提高氮肥利用率提供理論支撐。

4結論

與不施氮相比，施氮可以提高花生根際微生物群落的豐富度和多樣性，以中量氮肥的Chao 1指數和Shannon指數最高?；ㄉH土壤細菌群落以變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等優勢菌門為主，施氮處理提高了變形菌門和放線菌門的相對豐度，但其豐度并沒有隨著施氮量的增加而一直增多。施氮處理下的OTUs數均多于不施氮，中氮處理下的OTUs數最多，且隨著氮肥施入量的增加呈先升高后降低的趨勢。不施氮和在低、中量氮肥施用范圍內，土壤微生物群落穩定，過量施入氮肥會導致土壤微生物群落不穩定。