金黃色葡萄球菌噬菌體生物學特性研究

趙翠 趙效南 閆超 胡明 張慶 駱延波 劉玉慶

摘要：本研究利用分離自生鮮牛乳樣品中的金黃色葡萄球菌作為宿主菌，從污水中分離得到一株噬菌體，命名為RPCSa20091。對其生物學特性研究結果顯示，該噬菌體屬于微球形有尾目噬菌體；宿主譜較寬，裂解率為81.8%；在40℃條件下噬菌體相對穩定，45℃條件下不生長，pH值在3-10時較穩定，pH值在1-2和11-12時噬菌體完全失活；其最佳感染復數為0.1；潛伏期為15 min．裂解周期為75 min。本研究結果為金黃色葡萄球菌噬菌體用于奶牛乳腺炎的治療提供了理論基礎。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；噬菌體；生物學特性

中圖分類號：S852.61+1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0135-05

金黃色葡萄球菌是一種重要的人畜共患病原菌，可導致人類和動物的多種疾病，例如敗血癥、心內膜炎、乳腺炎以及腦膜炎等，嚴重威脅公共健康。同時金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最常見的病原體之一。中國約有10%-40％奶牛乳腺炎是由金黃色葡萄球菌引起，受感染的動物通常將金黃色葡萄球菌排入到乳汁中。目前治療金黃色葡萄球菌感染主要依靠抗生素，但金黃色葡萄球菌可以獲得賦予對不同抗生素耐藥性的基因。最廣泛且常見的耐藥菌株是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對所有B-內酰胺類藥物耐藥。盡管世界各國科學家在乳腺炎的病原、疫苗研發等方面取得大量研究成果，但目前還沒有很好的措施能夠達到滿意的防治效果。噬菌體作為一種寄生在細菌中的病毒，能夠有效裂解細菌，近年來被認為具有替代抗生素治療金黃色葡萄球菌的潛在價值。

噬菌體是一種可以殺死目標宿主細菌的病毒，能夠將遺傳物質注入細菌中并在其內復制。與抗生素相比，噬菌體具有多種優勢，例如，不會破壞宿主的正常微生物菌群、具有很強的宿主特異性、只在感染部位復制且無嚴重副作用，而且可以與抗生素進行協同治療以達到更好的治療效果，是一種理想的抗生素替代品。目前已經鑒定出200多種裂解性金黃色葡萄球菌噬菌體。同時金黃色葡萄球菌噬菌體體內和體外治療試驗結果表明其具有有效的抗菌活性。皮下注射金黃色葡萄球菌噬菌體可預防家兔和小鼠膿腫的形成。然而金黃色葡萄球菌噬菌體的研究和治療還有限，仍需要更多的科研探索來支持。

本研究以從生鮮牛奶樣品中分離的金黃色葡萄球菌為宿主進行噬菌體分離鑒定，對篩選的噬菌體進行生物學特性分析，以期為金黃色葡萄球菌噬菌體的研究和后續的治療防控提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗菌株

金黃色葡萄球菌分離自生鮮牛乳樣品，由山東省農業科學院畜牧獸醫研究所公共衛生研究室提供。

1.2噬菌體的分離與純化

從濟南市某奶牛場污水處理池內采集20 mL污水樣品，4 000xg離心15 min后，取上清，用0.22 um濾膜過濾除菌后置于4℃備用。取生長到指數期的金黃色葡萄球菌500 uL與500 uL濾液混合，置于37℃恒溫培養箱中，200 r/min培養16 h。混合物4 000xg、4℃離心15 min，取0.1mL上清液與0.1 mL金黃色葡萄球菌在3 mL LB（0.7%瓊脂）軟瓊脂中混合均勻并傾倒平板，然后用1.5%瓊脂覆蓋在LB培養基表面，37℃培養過夜后，用注射器針從平板中挑取邊緣整齊、型體較大、色澤透亮的噬菌體斑塊接種到宿主菌培養液中，37℃恒溫搖床中培養3h后，過濾取上清，取10倍倍比稀釋的上清稀釋液與宿主菌混勻吸附后，采用雙層瓊脂平板法培養，重復3次以上，直至在同一個平板上噬菌斑形態大小基本一致，即得到純的噬菌體。

1.3噬菌體的電鏡觀察

噬菌體原液經4 000×g、4℃離心40 min獲得效價為10 pfu/mL的噬菌體濃縮液，并將其懸浮在2％戊二醛中。靜置30 min后，4 000xg離心40 min，然后將沉淀懸浮在PBS中。將噬菌體樣品滴加到銅網上吸附10 min，用濾紙小心吸除噬菌體溶液。滴加1%乙酸雙氧軸溶液5 uL，染色2 min后吸除染液，室溫晾干后用透射電鏡觀察。

1.4噬菌體宿主譜測定

將121株金黃色葡萄球菌分離株培養至指數生長期，取100 uL菌液與100 uL噬菌體混勻后，37℃孵育15 min，然后通過雙層平板法觀察有無噬菌斑形成。

1.5噬菌體穩定性

參照參考文獻[14]進行。噬菌體熱穩定性測定：將噬菌體懸浮液（10 pfu/mL）在不同溫度下（4、37、50、60、70℃）孵育1h；噬菌體最適pH值測定：將噬菌體懸浮液（10 pfu/mL）放置在不同pH值（1-12）的SM緩沖液中，37℃孵育1h。噬菌體效價通過雙層平板法測定。

1.6噬菌體最佳感染復數（MOI）的測定

參照Li等的方法。首先將宿主菌濃度調整為10 cfu/mL，然后將不同稀釋濃度的噬菌體按照不同的感染復數（MOI= 0.001、0.01、0.1、1、10）與等體積的菌液混合，37℃、200 r/min振蕩培養4h。將混合物4 000xg離心10 min后，通過雙層平板法測定噬菌體效價，效價最高的即為最佳感染復數。

1.7噬菌體一步生長曲線的測定

參照Pajunen等的方法。將500 uL噬菌體（10 pfu/mL）和500 uL宿主菌（10 cfu/mL）在37℃條件下培養5min。將混合物以13 000xg離心1 min，棄上清，將沉淀物懸浮在3 mL LB培養液中，37℃、100 r/min振蕩培養。每15 min取樣500 uL，連續取樣120 min，使用雙層瓊脂平板法測定噬菌體的效價，并繪制噬菌體生長曲線。試驗重復3次。

1.8數據處理與分析

本試驗所有數據均使用統計分析系統SPSS 20.0進行分析，使用Graphpad prism 5 software（Graphpad Software Inc.，San Diego，CA）作圖。

2結果與分析

2.1噬菌體的分離與純化

從奶牛場污水樣品中分離到一株金黃色葡萄球菌噬菌體，純化3代后，獲得直徑大小為1-2mm、邊緣整齊透亮的噬菌斑（圖1），命名為RPC-Sa20091。

2.2噬菌體的電鏡觀察

透射電鏡觀察結果（圖2）發現，噬菌體RPC-Sa20091為微球形有尾目噬菌體，由清晰的正二十面體頭部和細長的尾部組成。頭部直徑約為56-59 nm，整個噬菌體長度約在194-294 nm之間。

2.3噬菌體宿主譜測定

結果顯示，噬菌體RPCSa20091能在99株金黃色葡萄球菌的雙層瓊脂平板上產生噬菌斑，表明噬菌體能夠裂解99株金黃色葡萄球菌，具有很寬的宿主譜，其裂解率為81.8％。

2.4噬菌體穩定性

噬菌體RPCSa20091的熱穩定性結果顯示，在40℃條件下噬菌體相對穩定，在45℃條件下不生長（圖3A）。噬菌體RPCSa20091的酸堿穩定性結果顯示，當pH值在3-10時，噬菌體比較穩定，但當pH值在1-2和11-12時完全失活（圖3B）。

2.5噬菌體最佳感染復數

噬菌體RPCSa20091最佳感染復數測定結果（圖4）顯示，當MOI為0.1時，噬菌體效價最高。

2.6噬菌體一步生長曲線

噬菌體RPCSa20091一步生長曲線結果（圖5）顯示，噬菌體具有較短的潛伏期，約為15 min，裂解周期為75 min，裂解量為10 pfu/mL。

3討論與結論

奶牛乳腺炎被認為是所有已知動物疾病中最昂貴的疾病，已被確定是影響奶牛健康最主要的疾病，可帶來巨大的經濟損失。噬菌體療法為控制由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供了一種新的方法。本研究以生鮮牛乳中分離的金黃色葡萄球菌為宿主菌，從奶牛場污水中分離純化得到一株噬菌體RPCSa20091，繼而對其進行一系列生物學特性分析。

通過電鏡觀察得知噬菌體RPCSa20091為長尾噬菌體，與報道的大多數已知的金黃色葡萄球菌噬菌體屬于長尾噬菌體相吻合，但王一帆等報道的噬菌體P42為短尾噬菌體，并且只能裂解宿主菌，宿主譜較窄。本研究中，噬菌體RPCSa20091具有較寬的宿主譜（81.8%），能夠裂解與奶牛相關的金黃色葡萄球菌，表明其具有潛在的噬菌體治療作用。噬菌體MSA6同樣具有寬的宿主譜，能夠裂解與牛乳腺炎相關的致病葡萄球菌以及與人類感染相關的耐抗生素金黃色葡萄球菌。噬菌體RPCSa20091穩定性結果顯示，在40℃條件下相對穩定，但在45℃條件下基本上不生長。蔡天舒等報道的噬菌體qdsa001在60℃條件下仍具有良好的耐受性，表明噬菌體RPCSa20091耐熱性較差。噬菌體RPCSa20091在pH值為3-10范圍內穩定存在，表明該噬菌體對酸堿溶液有一定的抵抗力，可以通過口服途徑進行治療。通過研究噬菌體RPCSa20091的一步生長曲線得知，該噬菌體與王倩等分離報道的噬菌體有著短潛伏期、長爆發期及高裂解量的優點一致。

綜之，噬菌體RPCSa20091具有高效裂解活性和較寬的宿主譜，通過了解其生物學特性，為用于由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎及相關疾病的預防和治療奠定了基礎。