哈茨木霉施用方式對煙草生長、黑脛病防治及誘導抗性的影響

匡志豪 王典 云菲 王兆雙 韓夢園 張幸博 王景 殷全玉

摘要：為探究生防菌株哈茨木霉對煙草生長促進和黑脛病防治效果的最佳施用方式，本試驗在溫室盆栽條件下分析了哈茨木霉浸種、灌根和葉面噴施3種施用方式對煙草生物學性狀、生理特性、煙草黑脛病防治效果以及誘導抗性的影響。結果表明，哈茨木霉浸種、灌根、葉面噴施處理對煙草地上部和地下部生物學性狀及生物量積累均具有顯著促進作用，整體表現為灌根>浸種>葉面噴施。哈茨木霉對煙株葉面積促進效果高于株高和莖圍，移栽后28 d經灌根處理煙株根系更加發達，總根長、根體積、分枝數較對照顯著增加，地上部和地下部鮮質量較對照分別增加86.14%和84.16%。灌根處理后煙株硝酸還原酶活性、根系活力、葉綠素含量均隨時間推移逐漸升高，在移栽后21 d達到穩定。哈茨木霉定殖量與防御性酶活性和煙草黑脛病防治效果呈正相關關系，經誘導煙草根系POD、PPO、PAL和CAT活性顯著升高。各時期灌根處理煙株體內哈茨木霉定殖量均顯著高于浸種和葉面噴施處理，煙草黑脛病發病率較對照降低75.00個百分點，病情指數降至13.89。綜上可知，移栽期哈茨木霉灌根處理能有效提高煙株生長質量，誘導煙株抗性增強，降低煙草黑脛病發生。

關鍵詞：哈茨木霉；施用方式；生物學性狀；生理特性；煙草黑脛病；誘導抗性

中圖分類號：S435.72 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0119-08

煙草是中國重要的經濟作物，由于長期連作及過量化肥、農藥施用，煙區土壤質量下降、病害發生日益嚴重、煙葉品質降低，同時對生態環境產生一系列負面影響。煙草黑脛病是由煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起的一種土傳真菌病害，在中國各煙區普遍發生，嚴重地塊發病率高達75％以上，是危害煙葉生產的主要病害之一，嚴重影響了煙葉生產的可持續發展。

木霉菌是一類廣泛存在于土壤中的拈抗真菌，通過競爭優勢、重寄生作用以及誘導植物產生抗性等方式，達到高效、安全、綠色防治效果。王獻慧等在花生種植前利用哈茨木霉浸種，有效提高了植株葉片數和側枝長，顯著降低了葉斑病發病率。王依純等通過棘孢木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉灌根，均提高了黃瓜幼苗葉綠素含量、硝酸還原酶活性以及根系活力，促進幼苗生長。張敏等采用綠色木霉葉面噴施玉米，對株高、根長均有促進效果，根活力、過氧化物酶活性及葉綠素含量較對照顯著升高。木霉制劑對植物促生防病效果隨使用方式不同存在較大差異，如劉峰等利用哈茨木霉浸種、拌土和葉面噴施處理均能促進玉米幼苗生長，其中拌土處理對植株地上部生長性狀、根長及生物量積累提高效果更顯著。張敏等認為木霉浸種和葉面噴施混合處理能有效增強玉米防御類酶活性，提高對玉米絲黑穗病的防治效果。肖密比較了哈茨木霉菌T2-16孢子懸浮液浸種、灌根以及摻拌基質對西瓜枯萎病的防治效果，其中木霉菌摻拌基質處理下的西瓜過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性提高最顯著，防治效果達到60%。

當前，利用木霉菌防治植物病害報道已有很多，但木霉菌施用方式對煙草的生長、病害防效以及誘導抗性的影響缺乏系統研究。本課題組利用前期篩選出對煙草黑脛病病菌有較強拮抗效果的哈茨木霉菌，研究哈茨木霉浸種、灌根和葉面噴施3種施用方式對煙草生物學性狀、生理特性、誘導抗性及煙草黑脛病防治的影響，旨在提高生產中木霉菌劑使用效果，為綠色煙葉生產提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試煙草品種 K326由河南農業大學煙草學院提供。

1.1.2供試培養基 PDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。燕麥瓊脂培養基（OA）：燕麥仁60 g，蔗糖20 g，瓊脂8g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

1.1.3供試菌株 哈茨木霉CGMCC 23294由中國農業科學院農業微生物菌種保藏中心提供：煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）由河南農業大學煙草學院提供。

1.1.4菌液制備 將哈茨木霉接入PDA平板于（27±1）℃培養5-7 d后，用無菌水沖洗孢子，制成1×10 7 cfu/mL孢子懸浮液備用。將煙草疫霉菌接人燕麥瓊脂（OA）培養基，（26±1）℃培養6-7d后，用無菌水沖洗孢子，并調節為1×10cfu/mL孢子懸浮液備用。

1.2試驗處理

本試驗于2021年6月至10月在河南農業大學許昌校區煙草基地溫室大棚內進行，棚內溫度28℃，濕度40%。盆栽土壤采用大田耕層土壤，基礎土壤肥力：速效鉀144.61 mg/kg，速效磷118.89 mg/kg，堿解氮70.50 mg/kg，有機質16.45g／kg，除去雜草和石子后過1 cm×1 cm篩網，按1.83g／kg添加復合肥（N：P2O5：K2O=1：1.5：3），充分混勻，裝入內口徑20.5 cm、高度13.5 cm的花盆，每盆裝土量3 kg。

1.2.1對照處理 將煙草種子表面消毒（質量分數75％乙醇，1 min；30%雙氧水，5 min）后，播種于裝有已滅菌基質的漂浮育苗盤中培育，總計50株。

1.2.2浸種處理 煙草種子表面消毒后，用哈茨木霉孢子懸浮液浸種處理48 h，無菌水漂洗干凈，播種于裝有已滅菌基質的漂浮育苗盤中，待煙苗到達成苗期裝盆移栽至溫室大棚，總計50株。

1.2.3灌根處理 消毒后的煙草種子，采用常規漂浮育苗，待煙苗到達成苗期裝盆移栽，利用哈茨木霉孢子懸浮液進行灌根處理。每株煙接種20mL，總計50株。

1.2.4葉面接種處理 煙苗長至成苗期后移栽，移栽當天，將哈茨木霉孢子懸浮液均勻噴施在煙苗葉片上直至葉表面布滿一層細微水珠而不滴落為止，每株煙均勻噴施20 mL，總計50株。

哈茨木霉孢子懸浮液灌根與葉面噴施處理時間相同，各處理挑選長勢均勻一致煙株同一時間移栽，且移栽方式與后續管理措施保持一致。

1.3測定指標及方法

1.3.1生物學性狀測定 移栽后28 d進行生長量指標測定，各處理選取5株，測量株高、莖圍、葉片長度和寬度（自上而下第5片葉），計算葉面積（葉面積=0.6345×葉長×葉寬）。將盆內土壤倒出，輕輕抖落根部土壤，用清水反復沖洗干凈，吸水紙吸干水分稱量地上部和地下部鮮質量：通過EPSON根系掃描儀將根系完整掃描的圖像存入計算機，利用WinRHIZO分析總根長、根表面積、平均根直徑、根體積及分支數：掃描后的根部同地上部在105℃烘箱殺青15 min后，70℃烘干測干質量及根冠比（地下部鮮質量／地上部鮮質量）。

1.3.2生理生化指標測定 移栽后7、14、21、28d分別采集各處理煙株自上而下第4片葉，避開葉脈，在葉片中部環狀切取0.5 g，采用丙酮乙醇提取比色法，測定葉綠素含量；將煙苗挖出，根部清洗干凈并吸干水分，稱取1.0 g，參照朱秀云等的方法，采用TTC法測根系活力：另外取0.1g煙株根部參照張春秋等的方法，采用活體分光光度法測根系硝酸還原酶活性，各生理指標測定3次重復，每次重復均來自同一煙株。

1.3.3哈茨木霉在煙株體內定殖規律 在移栽后7、14、21、28 d分別取各處理煙株根部、莖基部和葉片各0.1 g混合，每株煙重復取樣3次，將混合樣品在液氮中凍干研磨成粉，采用生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒進行真菌DNA提取。依照哈茨木霉測序結果根據其rDNA轉錄間隔區特有保守序列設計引物EFl-728F（5 -CATCGAGAAGITCGAGAAGG-3）和TEFILL Er-ev（5- AACTTGCAGGCAATGTGG -3'）并對其序列進行PCR擴增。PCR反應體系：模板DNA 4.0uL，EFl-728F和TEFILL Erev各1.0 uL，2x TaqPCR Star Mix 25 uL，加ddH2O樸足至50 uLPCR反應程序：94℃預變性4 min；94C變性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環：72℃延伸10 min，16℃保存。取40 uL擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，采用ToIoPrep柱式PCR純化／膠回收試劑盒對目標條帶進行純化，利用超微量分光光度計檢測其濃度，取3次結果平均值，各處理重復3次。

1.3.4抗病性及誘導抗性指標測定 各處理煙苗在移栽后28 d，采用灌根接種法，將配制好的煙草疫霉孢子懸浮液（1xl0 5cfu/mL）20 mL均勻接種在煙株根部土壤，14 d后調查發病率，計算病情指數及防治效果，并測定各處理煙株根部過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化氫酶（CAT）活性，各處理3次重復。

煙草黑脛病分級標準參照中華人民共和國煙草行業標準YC/T 39-1996。

發病率（%）=病株數／調查總株數×100：

病情指數=∑（病級數×該級病株數）／（最高病級數×調查總株數）×100：

防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）／對照病情指數×100。

1.4數據處理

利用Microsoft Excel 2019進行數據處理和圖表制作，通過SPSS 25.0在0.05水平上對數據進行差異顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1哈茨木霉不同施用方式對煙草生物學性狀的影響

2.1.1哈茨木霉不同施用方式對煙草地上部生物學性狀的影響 由表1和圖1可知，與對照相比，在移栽后28 d，哈茨木霉不同施用方式對煙草地上部生長均具有明顯促進作用，以灌根處理對煙草株高和葉面積提高效果最顯著，較對照分別增加54.22%和67.42%（P<0.05），顯著高于浸種和葉面噴施處理：相比對照處理，3種施用方式對煙株莖圍影響均達顯著水平，以葉面噴施處理增幅最大，達到23.40%（ P<0.05）。整體來看，哈茨木霉對煙草葉面積促進效果優于莖圍和株高。

2.1.2哈茨木霉不同施用方式對煙草地下部生物學性狀的影響 由圖2和表2可知，3種施用方式對煙草根部各指標表現出不同程度地促進作用，哈茨木霉灌根處理的煙株在移栽后28 d根系更發達，各根系指標均高于浸種和葉面噴施處理。經灌根處理煙株總根長、根表面積、平均根直徑、根體積和分支數較對照增加顯著，增幅分別達43.21％、62.91%、87.63%、119.79％和80.46％；浸種處理對煙草根系各指標提高也較顯著，較對照分別提高28.86％、49.60％、27.84%、85.03%和42.87％；相比對照，葉面噴施處理對煙草根表面積、平均根直徑及根體積影響不顯著，較對照增加14.02%、4.12％和17.47％。結合煙株地上部發育（表1）可知，哈茨木霉施用方式對煙草地上部和地下部生物學性狀影響相同，即灌根>浸種>葉面噴施。

2.1.3哈茨木霉不同施用方式對煙草生物量積累的影響 由表3可知，哈茨木霉浸種、灌根和葉面噴施處理后煙株地上部和地下部生物量積累均高于對照。以灌根處理對煙株生物量積累促進作用最強，其次是浸種處理，葉面噴施效果相對較弱。灌根處理煙株地下部鮮質量、地上部鮮質量、地下部干質量和地上部干質量較對照分別增加84.16％、86.14%、63.29%和64.17%（P<0.05）.浸種處理煙株地上部鮮質量和干質量增幅分別為62.49％和58.35％（P<0.05），與灌根處理間無顯著差異。對照、浸種和灌根處理之間煙株根冠比差異不顯著，經葉面噴施后煙草根冠比有所下降，說明哈茨木霉能促進煙草地上部和地下部生物量積累，并不能有效提高煙草根冠比。

2.2哈茨木霉施用方式對生理特性的影響

2.2.1哈茨木霉施用方式對煙草根系硝酸還原酶活性和葉片葉綠素含量的影響 由圖3可知，葉綠素含量隨移栽時間逐漸增加，各時期含量均表現為灌根>浸種>葉面噴施>對照。其中浸種和灌根處理各時期葉綠素含量與對照之間均呈顯著差異，最大增幅為33.70%和51.52％（P<0.05），分別出現在移栽后第7天和14天，兩處理間差異隨時間逐漸減小，在移栽后第28 d浸種與灌根處理之間葉綠素含量無顯著差異。移栽后7d葉面噴施與對照間葉綠素含量差異不顯著，在第21天，兩處理間差值達到最大，相比對照提高21.61％（P<0.05）。

各時期3種施用方式煙草根系硝酸還原酶活性與對照之間均呈顯著差異，總體變化趨勢與葉綠素相同，各處理硝酸還原酶活性隨移栽時間逐漸升高，以灌根處理最高。浸種和灌根處理酶活性在移栽后21 d較對照增幅達到最大，分別為29.54%和55.72％（P<0.05）：葉面噴施處理酶活性在移栽后第14天較對照提高24.77％（P<0.05），移栽后28 d灌根處理煙草根系硝酸還原酶活性最高，浸種與葉面噴施處理之間無顯著差異。

2.2.2哈茨木霉施用方式對煙草根系活力的影響 由圖4可知，哈茨木霉處理可以不同程度提高煙草根系活力，3種施用方式煙草根系活力隨移栽天數呈現先升高后降低的趨勢。其中以灌根處理促進作用最顯著，峰值出現在移栽后第14天，相較對照增幅最大，達到41.71％（P<0.05）；浸種和葉面噴施處理根系活力峰值均出現在移栽后第21天，較對照分別提高20.35%和12.99％（P<0.05）。隨移栽時間延長對照處理煙株根系活力逐漸升高，與各處理間差值呈逐漸縮小趨勢，但在移栽后28 d仍顯著低于哈茨木霉處理。

2.3不同施用方式下哈茨木霉在煙草體內定殖規律

由圖5可知，通過PCR擴增檢測，對照處理煙株各時期體內哈茨木霉DNA含量均為零。浸種和灌根處理煙株體內哈茨木霉定殖量隨移栽時間延長呈先升高后降低趨勢，分別在移栽后第14天和第21天達到最大值，各時期灌根處理煙株體內哈茨木霉定殖量均顯著高于浸種和葉面噴施處理：經葉面噴施處理煙株體內哈茨木霉定殖量隨時間逐漸減少。

2.4哈茨木霉施用方式對煙草誘導抗性的影響

2.4.1哈茨木霉施用方式對煙草黑脛病拮抗效果的影響 對照處理煙株發病率和病情指數均顯著高于哈茨木霉處理，以灌根處理對煙草黑脛病防治效果最顯著，達到75.94％，病情指數為13.89（P<0.05）：浸種和葉面噴施處理下煙草黑脛病發病率、病情指數和防治效果差異不顯著，兩處理防效分別為53.32%和49.48％。

2.4.2哈茨木霉施用方式對煙草誘導抗性的影響 由表5可知，哈茨木霉對煙草根部防御性酶活性具有誘導效應。3種施用方式均有效提高了煙草根部POD活性，但三者之間無顯著差異，灌根處理后煙草POD活性較對照增加28.70%（P<0.05），高于浸種和葉面噴施處理。

PPO活性以灌根處理最高，較對照提高71.34%（P<0.05）；浸種與葉面噴施處理之間無顯著差異，分別較對照增加33.84％和39.63％（P<0.05）。

浸種處理后煙草根部PAL活性較對照升高5.87％，與對照間無顯著差異：灌根和葉面噴施處理能顯著提高PAL活性，分別提高66.75%和32.52％（P<0.05）。

浸種和灌根處理對CAT活性促進作用最明顯，較對照分別提高80.33％和105.92％（P<0.05），葉面噴施效果顯著低于浸種和灌根，與對照之間差異不顯著。

綜上結果，3種施用方式對煙草根部POD、PPO、PAL和CAT活性均有促進作用，其中以灌根處理對各防御性酶活性誘導效果最顯著。POD活性受施用方式影響較小，PAL和CAT活性受施用方式影響最大。在生物脅迫條件下，灌根處理有利于激發煙草根部POD、PPO、PAL和CAT活性，提高煙草誘導抗性。

3討論與結論

木霉菌作為一種廣譜性生防菌，至少對18個屬20余種病原真菌和多種病原細菌有拮抗效果。木霉不僅在植物土傳病害防治中具有重要作用，還能促進植物生長、提高植物免疫力、增強抗逆性。

關于木霉促進植株生長已有很多報道。楊春林等通過哈茨木霉T-h-30灌根處理后，黃瓜、番茄、芹菜幼苗株高、地莖及鮮質量均較對照顯著增加：王禹佳等利用綠色木霉處理玉米后，相比對照總根長、根體積和根表面積分別提高74.0％、65.0％和47.4％。本研究中哈茨木霉經3種施用方式處理后的煙株株高、葉面積、總根長、根體積、地上部鮮質量和地下部鮮質量等均高于對照，與前人研究結果相似，其中灌根處理對以上指標促進效果最顯著。其原因可能是灌根處理后土壤和煙株體內哈茨木霉定殖量更多，其代謝產物中具有幼苗生長的類植物生長素6-PP（6-n-pemyl-6H-pyran-2-one）以及可降解乙烯前體物質的ACC脫氨酶，緩解了乙烯對煙株生長的抑制作用。哈茨木霉通過誘導增加煙草側根、叢生根、延伸根長度等方式，形成更發達的根系網絡，其中總根長和分枝數的增加有利于煙株從更廣泛的土壤中獲取水和養分，根體積和根表面積的提高擴大了與土壤的接觸面積和吸收范圍：另一方面部分微溶或難溶的礦物質在哈茨木霉作用下溶解后被根系吸收，從而加快煙株生長。

各生理指標變化是衡量植株生長質量的重要依據，有研究表明棘孢木霉和哈茨木霉灌根均能顯著提高黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、葉片硝酸還原酶活性等生理指標。楊春平等發現在較高濃度木霉L24作用下，浸種處理相較葉面噴施更有利于提高玉米葉綠索含量和根系活力。本研究結果顯示3種施用方式對煙株各生理指標促進效果整體表現為灌根>浸種>葉面噴施，經灌根處理后，煙株葉面積和葉綠素含量顯著提高，加快了葉片光合速率，增加碳水化合物的形成和積累：同時煙株根系活力和硝酸還原酶活性升高，提高土壤水肥吸收和氮素利用效率，進而促進煙株生長和生物量的積累。

植物-木霉-病原菌互作是一個復雜的系統，誘導抗性在植物抗病過程中起著至關重要的作用，它是指在外界因子誘導下，植物啟動自身防御系統，增強對病原菌的抗性現象，通常以防御性酶活性表示。已有研究表明木霉菌能通過誘導植物體內POD、CAT、PPO、PAL等防御性酶活性升高，抑制病原菌入侵。本試驗結果顯示，不同施用方式下，煙株體內哈茨木霉定殖量存在顯著差異，以灌根處理各時期定殖量最高，同時哈茨木霉定殖量與煙草防御性酶活性和黑脛病防治效果呈正相關。說明在煙草疫霉脅迫下，哈茨木霉定殖量是影響煙草防御活性的關鍵因素。本試驗以灌根處理后煙株根系POD、PPO、PAL和CAT活性提高最顯著，分別較對照升高28.70%、71.34％、66.75%和105.92％，煙草黑脛病防治效果達到75.94%。與宋玉娟、莊敬華、陳捷等的研究結果一致。因此，誘導抗性可能是哈茨木霉防治煙草黑脛病的重要機制。

綜上所述，在移栽時利用哈茨木霉灌根，能有效促進煙株生長，提高對煙草黑脛病的防治效果，在病原菌脅迫下，有利于誘導煙株產生抗性，抑制病原菌侵染，增強抗病能力。