兩種處理對西洋參根際土壤理化性質及真菌群落的影響

舒瑜 蔣景龍 陳德經 李麗 董艷鑫

摘要：本試驗通過西洋參根水提液（CT）和連作4年西洋參土壤浸提液（ST）定期澆灌西洋參幼苗，研究兩種處理對西洋參幼苗生長及土壤理化性質和真菌群落的影響。結果表明，與CK組相比，CT和ST組死苗率明顯升高；CT組堿解氮和速效鉀含量、轉化酶和脲酶活性顯著上升，pH值和銨態氮含量均顯著下降，ST組pH值和速效磷、銨態氮含量顯著下降，堿解氮含量顯著上升。利用Illumina Miseq測序，共獲得高質量序列768 262條，PCA分析顯示3組樣品真菌結構存在顯著差異。與CK組相比，CT組和ST組Cha01指數和ACE指數下降，Shannon指數和Simpson指數升高。在門水平，被孢霉門（MortierellomycoIa）、子囊菌門（AscomycoIa）、壺菌門（ChyIridiomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為3組樣品中的差異菌門。兩處理明顯抑制了西洋參幼苗的生長，并導致根際土壤理化性質和真菌群落的變化，為進一步闡明西洋參連作障礙產生機理提供了依據。

關鍵詞：西洋參；連作障礙；微生物群落；土壤理化性質；高通量測序

中圖分類號：S567.5+3：S1544 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0084-08

西洋參（Panaa; quinquefofiw L）別名美國花旗參，五加科多年生草本植物，有“綠色黃金”之稱，原產于美國和加拿大。20世紀80年代引入中國，并逐漸在陜西留壩、山東威海和東北吉林等地大規模栽培。目前西洋參栽培時連作障礙問題極其嚴重，導致西洋參生長不良，嚴重減產。連作障礙是指同一塊耕地不能連續種植相同作物的現象，主要與土壤理化性質的改變、化感自毒作用和土壤微生物的區系變化三大因素有關，且三者之間相互影響。半夏隨其重茬次數增多，可溶性蛋白增加，土壤全氮、全磷和堿解氮含量降低，微生物群落結構趨于簡單，且致病菌增多，有益菌減少。根際微生物菌群的組成可對植物生長發育產生影響，植物亦能通過調節pH值、土壤養分和根系結構來塑造它們自己的根際微生物群落。真菌是土壤微生物中種類和數量最多的類群之一，在與植物互作方面發揮著一定的生態作用，有些真菌可以分解植物殘渣，為植物提供營養：有些真菌會引起植物病害，影響植物生長。不同年限的植物根際微生物結構也有差異，且微生物數量隨種植時間而降低。土壤中微生物種類復雜且大多數不能在條件培養基上生長，末端限制性片段長度多態性分析（T-RFIP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、單鏈構象多態性分析（SSCP）以及實時定量PCR等傳統研究土壤微生物群落多樣性和組成的方法不足以獲取全面的微生物群落信息。隨著方法的進步，高通量測序技術已經成為分析微生物類群更全面、更準確、靈敏度更高的工具。袁源等采用高通量測序技術研究連作覆土下靈芝（Ganoderma lucidum，Karst）真菌群落變化，發現隨著連作年限的增加，真菌多樣性逐年降低。Miao等對2年生健康三七（Panax notoginseng）的根際真菌群落進行高通量測序分析，發現接合菌屬和子囊菌屬為優勢菌群。

董艷鑫等證明西洋參根水提液和重茬土壤浸提液對西洋參種子萌發及幼苗生理存在顯著影響，表明其中可能存在某些化感物質可影響土壤微生物的類群、數量和植物自身生長發育。很多學者研究表明，相對于西洋參水提液的化感作用，土壤浸提液更接近植物實際環境。從植物一土壤一微生物三者關系來探討作物連作障礙已經成為一個新的研究思路和重要發展趨勢。因此，本研究分析了西洋參水提液和西洋參土壤浸提液對西洋參幼苗、根際土壤理化性質以及根際土壤真菌群落的影響，以期為緩解西洋參連作障礙提供有效策略。

1材料與方法

1.1采樣與材料處理

2019年11月5日于陜西省留壩縣火燒店鎮墩墩石村西洋參種植基地（33°57′N，106°86′E）進行采樣，海拔1100 m。在連續種植西洋參4年的地塊采用“五點采樣法”采集土壤（土壤深度18-20 cm）和4年生健康西洋參，置于冰盒中用于土壤浸提液和西洋參根水提液的制備。清洗后的西洋參放入4℃冰箱保存，土壤樣品過2 mm篩后置于陰涼處自然風干。西洋參種子購自留壩縣西洋參研究所。營養土購自申之北有機土店，為長白山營養有機土，有機質≥30%，pH值為4.8-6.5，執行標準為Q/SZB001-2018。

1.2西洋參根水提液及土壤浸提液制備

稱取4年生西洋參50.0 g，打碎后加0.2 L蒸餾水，混勻，超聲提取1h后浸泡過夜，用4層紗布過濾2次，所得濾液在7 000 r/min下離心10min，取上清液將其稀釋至0.10 g/mL，4℃低溫貯藏待用。稱取500 g已過篩且風干的土壤，加入1L蒸餾水，混勻后超聲提取1h，浸泡過夜，用濾紙過濾得0.50 g/mL土壤浸提液，4℃低溫貯藏待用。西洋參根水提液及其土壤浸提液在使用前121℃滅菌20 min，以排除病原菌影響。

1.3西洋參根水提液及其土壤浸提液對西洋參幼苗的處理

選取露白2 mm且狀態健康的西洋參種子，播種到無菌營養土中，每盆（31.5 cm×24.5 cm×9.5 cm） 40粒。分別使用蒸餾水（CK）、土壤浸提液（ST）和西洋參根水提液（GT）澆灌西洋參幼苗，一周澆液3次，每次300 mL，每個處理4個重復，在晝／夜溫度為24℃/21℃、光照／黑暗為12h/12 h的培養間培養西洋參幼苗。90 d后收集待測土壤，過1 mm篩，一份放置陰涼處風干，用于理化性質及酶活性測定：一份保存于-80℃冰箱，用于土壤真菌檢測。

1.4土壤理化性質及酶活性測定

配制土：水為1：2.5（w/v）的溶液，充分振蕩3min后靜置30 min，用pH計測定pH值；采用高智能土壤養分檢測儀YT-TR01（山東云唐智能科技有限公司）測定土壤堿解氮（AN）、銨態氮（AMN）、速效磷（AP）、速效鉀（AK）、有機質（OM）含量；參照關松萌的方法，采用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性，采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定土壤轉化酶（INV）活性，采用比色法測定土壤脲酶（URE）活性，采用磷酸苯二鈉比色法測定土壤磷酸酶（PHO）活性。

1.5土壤基因組DNA提取和PCR擴增

按照TIANamp Soil DNA Kit（TIANGEN BIO-TECH）試劑盒說明書提取土壤微生物基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度。將基因組DNA用超純水稀釋，用含有Bar-code的特異引物F（5_CITGGTCA，ITTAGAG_GAAGTAA-3）和R（5-GCTGCGTTCITCATCGAT-GC-3）擴增ITSl-1F區域。PCR反應體系：PHu-sion@ High-Fidelity PCR Master Mix 15 uL，模板DNA 2 uL，F、R引物（10 umol/L）各1UL，ddH20補足至30 uL。反應程序：98℃預變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環：最后72℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用Qiagen公司的膠回收試劑盒對目的條帶進行回收。

1.6文庫構建和上機測序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒構建文庫，隨后經過Qubit和Q-PCR定量，檢驗合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.7生物信息學分析

采用余妙等的方法基于Illumina NovaSeq測序平臺對該文庫進行雙末端測序（Paired_End）及后續分析。

1.8數據處理

利用Microsoft Excel 2010軟件處理數據，使用SPSS 22.0進行試驗數據分析。

2結果與分析

2.1兩種處理對西洋參幼苗及土壤參數影響

CK、GT、ST組西洋參幼苗在播種14 d后達到最大出苗率，分別為98.33%、88.33%、82.50%，繼續處理后，GT組和ST組西洋參幼苗逐漸死亡。第45天時，GT組和ST組西洋參幼苗死苗率達到74.58％和64.59％（圖1），分別是CK組的4.38倍和3.77倍，表明西洋參水提液及其土壤浸提液明顯抑制西洋參幼苗的生長。

由表1可知，GT和ST處理組的pH值和銨態氮含量較CK組均顯著下降，其中GT組和ST組pH值分別下降0.45和0.44，表明兩種處理下的土壤有酸化趨勢：GT組和ST組中堿解氮含量顯著升高，分別為CK組的4.00倍和1.75倍：GT組中速效鉀含量顯著升高，為CK組的1.40倍：ST組中速效磷含量顯著下降，表明兩種處理對西洋參幼苗根際土壤理化性質有顯著影響。與ST組相比，GT組銨態氮含量顯著降低21.96%：速效磷、速效鉀、堿解氮含量顯著升高，分別升高40.75%、31.13%和129.09%。

GT組中轉化酶和脲酶活性顯著高于CK組，分別為CK組的12.09倍和1.43倍，過氧化氫酶和磷酸酶活性無明顯變化，表明GT組土壤有利于西洋參對營養物質和氮的吸收：而ST組與CK組相比酶活性變化較小。與ST組相比，GT組轉化酶和脲酶活性顯著升高，分別為ST組的6.11倍和1.64倍，過氧化氫酶和磷酸酶活性無顯著變化。

2.2真菌菌群測序深度及PCA分析

由圖2A可知，12個樣品的稀釋曲線均趨于平坦，表明測序量趨于飽和，更多的測序對產生新的OTU數目影響較小。圖2B為基于OTU水平的PCA圖，PC1和PC2分別代表18.11%和14.97%的真菌群落變化，3組樣品能夠被明顯分開，且每組樣品都有組內聚集現象，表明不同處理的樣品真菌群落結構差別明顯，同組樣品真菌群落構成差異較小。ST組與CK組和GT組的距離均較近，但CK組與GT組距離較遠，說明ST組與CK組和GT組分別具有較高的真菌群落相似性。

2.3真菌菌群多樣性分析

通過對高通量測序結果除雜等質控步驟后，CK組、GT組、ST組分別得到拼接序列85 318、86 957、75 112條，去除嵌合體序列得到有效序列分別為67 796、64 733、59 536條，有效率分別為79.46%、74.44%及79.26%。根據97%序列相似度進行水平聚類，CK組、GT組、ST組中各包含OTU數目為393、321、319個，3組樣品中共有OTU數為212個，CK組、GT組、ST組特有的OTU分別為93、47、61個，GT組和ST組共有OTU數目最少，為223個，表明GT組與ST組物種豐度差異較大。Chao 1指數和ACE指數用來表示土壤樣品中真菌群落物種總數，指數越大代表物種種類越多。CK組Cha01指數和ACE指數最高，為264.48和273.93，分別為GT組和ST組的1.12、1.40倍和1.16、1.41倍（表2）。Shannon指數和Simpson指數綜合反映土壤真菌群落的豐富度和均勻度，其指數越大代表均勻度和多樣性越高。CK組Shannon指數和Simpson指數最低，為3.68和0.86，3組真菌群落均勻度為CK組

2.4真菌組成及差異菌群分析

使用相對豐度柱形累加圖比較3組樣品在門和屬水平的物種組成。圖3A為3組樣品在門水平最大豐度排名前10的物種，子囊菌門（Ascomy-cota）為3組樣品中的優勢菌群，占真菌總數的63.77％-86.53％，其次為被孢霉門（Morlierellomy-cota.0.74％-21.32％）、壺菌門（ChyUidiomycota，0.06%-5.81％）、隱真菌門（Rozellomycota，0.04%-4.80%）、擔子菌門（Basidiomycota，0.07％-3.57％）和球囊菌門（Glomeromycota，0.02％-1.13％），其中被孢霉門和擔子菌門在GT組中最高，分別占15.01％和2.30％；隱真菌門在ST組中最高，占2.12%：CK組中壺菌門、擔子菌門、隱真菌門和球囊菌門豐度最低，均小于0.02%。梳霉門（Kickx-ellomycota）為ST組中特有菌門，但豐度最高僅為0.06％，捕蟲霉門（Zoopagomycota）僅在CK組中出現，豐度不到0.01％。表明3組樣品在門水平具有顯著的物種豐度差異。

在屬水平上3組樣品總共得到173個真菌類群，圖3B為豐度前10的物種，3組中優勢菌屬為鐮刀菌屬（Fusarium，23.99％-29.20%）、Gilmamella屬（8.06％-37.43％）、短梗蠕孢屬（Trichocladium.4.75％-8.57％）、被孢霉屬（Mortierella.1.74％-8.70％）和毛殼菌屬（Chaetoraium，2.65％-4.77％），其中CK組和ST組中Gilmaniella屬和毛殼菌屬豐度明顯高于GT組，分別升高364.14%和356.67%，而鐮刀菌屬和被孢霉屬明顯低于GT組，分別降低21.90％、35.82％和56.86％、80.00％；ST組短梗蠕孢屬豐度顯著高于CK組和GT組，分別提高80.52％和28.75％；未鑒別屬（3.41％）和被孢霉目中未鑒別屬（2.90％）是GT組優勢屬，且明顯高于CK組和ST組：Cladorrhinum，屬（2.67％）和隱真菌門中未鑒別屬（2.11％）是ST組優勢屬，其豐度顯著高于CK組和GT組。表明在屬水平3組樣品物種豐度具有顯著差異。

為了進一步探究3組真菌群落在門和屬水平的結構關系，尋找組間的差異物種，利用MetaStat方法計算組間的物種豐度，發現在門水平上有4個差異物種（圖4A）。CK組和ST組子囊菌門豐度顯著高于GT組：擔子菌門和被孢霉門豐度GT組顯著或極顯著高于CK組和ST組：壺菌門豐度ST組顯著高于GT組（P<0.05），極顯著高于CK組（P<0.01）。由圖4B可知，屬水平上有3個差異物種。CK組的Gilmaniella屬豐度極顯著高于GT組：被孢霉目未鑒別屬和被孢霉科未鑒別屬在GT組中豐度最高，均顯著高于ST組，CK組和ST組中均無顯著差異。

2.5土壤理化性質與真菌的關聯分析

采用Spearman相關系數（Spearman's

rank correlation coemcients）研究土壤理化性質與微生物物種之間的相互變化關系。如圖5所示，土壤pH值與曲霉屬（Aspergillus，0.79）和周刺座霉屬（Volutella，0.82）呈極顯著正相關，而與木霉屬（Trichoderma，-0.81）和Cladorrhinum屬（-0.74）呈極顯著負相關（P<0.01）：銨態氮可顯著抑制Cybedindnera屬（-0.74）和未鑒別屬（-0.88）真菌生長（P<0.01）；速效磷含量與曲霉屬（0.68）、彼得殼屬（0.58）和被孢霉屬（0.64）呈顯著正相關，與球囊菌門未鑒別屬（-0.76）、隱真菌門未鑒別屬（-0.64）和Cladorrhinum，屬（-0.77）呈顯著或極顯著負相關（P<0.05）；速效鉀能極顯著促進擔子菌門未鑒別屬（0.73）、被孢霉目未鑒別屬（0.80）、頭梗霉屬（0.84）、未鑒別屬（0.78）真菌的生長，抑制Cilmanietla屬（-0.83）生長（P<0.01）；堿解氮含量和土壤轉化酶活性導致的真菌變化規律基本一致，極顯著促進木霉屬（0.73）和未鑒別屬（0.83）真菌生長（P<0.01）：土壤脲酶活性與被孢霉屬呈極顯著正相關（P<0.01），與錐蓋傘屬（-0.60）呈顯著負相關（P<0.05）；土壤磷酸酶活性增加導致隱真菌門未鑒別屬（0.83）極顯著增多（P<0.01），周刺座霉屬（-0.79）極顯著減少（P<0.01）。以上結果表明，土壤理化性質和酶活性與土壤真菌密切相關。

3討論與結論

土壤理化性質是植物正常發育的關鍵，植物分泌的物質會影響土壤理化性質。本研究發現，與CK組相比，GT組顯著降低了銨態氮含量，顯著提高了速效鉀和堿解氮含量，ST組中銨態氮和速效磷含量顯著降低，而堿解氮含量顯著提高。王興飛等研究發現，使用鳳丹（Paeonia ostil）根際土壤浸提液澆灌玉米幼苗顯著降低了根際土壤中全氮、全磷和有機碳含量：張冉用種植過西洋參1至4年的土壤水提液分別澆灌未種植過西洋參的土壤，發現4年生參齡土壤處理的新土中銨態氮和有機質含量顯著提高，而速效磷含量顯著降低，與本研究結果相似。土壤銨態氮、速效鉀和速效磷能夠被植物吸收利用，其含量下降不利于植物生長，堿解氮是衡量土壤氮素的重要指標，而兩種處理下的堿解氮含量均升高，可能是由于兩種水提液中的有機質高于蒸餾水，也可能是兩種水提液中的某些物質影響微生物，進而提高了堿解氮含量。

土壤酶活性與土壤物質的轉化密切相關，植物浸提液對土壤酶活性具有顯著影響。張冉使用種植西洋參4年的土壤水提液澆灌新土，發現新土中土壤轉化酶活性升高，過氧化氫酶、堿性磷酸酶和脲酶活性降低：孫雪婷等發現三七連作能顯著降低其栽培土壤中蔗糖酶、過氧化氫酶、磷酸酶和脲酶活性。在本研究中，ST處理組相比于CK組堿性磷酸酶活性顯著升高，過氧化氫酶、轉化酶和脲酶活性沒有顯著變化：GT組中轉化酶和脲酶活性顯著升高，過氧化氫酶和磷酸酶活性沒有顯著變化。張亞玉等測定不同連作時長的西洋參土壤酶活性發現，相比于未種植過西洋參的土壤，種植4年西洋參的土壤過氧化氫酶和脲酶活性顯著升高。本研究中兩種處理均改變了上述酶活性，可能是由于兩種水提液中的代謝物質直接作用于土壤酶，也可能是水提液影響了土壤理化性質和微生物結構，間接影響酶活性。

藥用植物分泌代謝物質到土壤中通常會引起原本微生物種類和數量的改變。一定濃度的阿魏酸、香草酸和丁香酸等酚酸類化合物能促進西洋參立枯絲核菌和根腐菌生長：焦曉林等發現4-40 mg/mL皂苷提取液能顯著抑制立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、毀滅柱孢菌生長（P<0.05）。本研究對不同處理下土壤微生物群落組成結構的變化進行分析發現，與CK組相比，ST和GT組處理后的西洋參幼苗根際土壤真菌群落多樣性降低，組成結構發生明顯變化。在門水平上，子囊菌門在3組中分布最廣泛。與CK組相比，GT組處理顯著降低了西洋參幼苗根際土壤中子囊菌門數量，而被孢霉門、壺菌門和擔子菌門豐度顯著上升（P<0.05）；ST組處理的西洋參幼苗根際土壤中，壺菌門和擔子菌門豐度明顯升高（P<0.05），這與袁源等研究發現靈芝隨著連作年限的增加，子囊菌門顯著減少，擔子菌門顯著增加的結果相似。由此可知，西洋參中存在某些代謝物質顯著抑制了子囊菌門的生長，而西洋參和西洋參連作土壤中含有的某些物質有利于被孢霉門、壺菌門和擔子菌門真菌的生長。以往研究認為，鐮刀菌屬真菌是導致西洋參患病的主要病原菌，通過高通量測序發現在屬水平上，鐮刀菌屬在3組中廣泛分布，其中，GT組豐度最高，是CK組豐度的1.28倍。此外，與CK組和ST組相比，GT組中Gilmamelta屬真菌顯著降低（P<0.05），被孢霉科未鑒別屬和被孢霉目未鑒別屬真菌顯著升高（P<0.05），與唐彬彬等發現被孢霉屬真菌隨著三七連作年限增加而減少的結果相反，這可能與西洋參中的甾類化合物有關。以上結果表明，西洋參在種植過程中，分泌的代謝物質影響了土壤微生物群落構成，進而影響西洋參生長發育。

土壤微生物作為根際微生態系統的主要構成，不僅與植物類型有關，與土壤理化性質同樣緊密聯系。有學者研究發現，Sphingobacterium的豐度與pH值（R2=0.856、P<0.05）和速效鉀含量顯著相關（R2=-0.65、P<0.05）；Helotiales（R2=0.53，P<0.01）、Hypocreales（R2=0.63，P<0.01）的豐度與土壤pH值顯著相關；Sordariomycete的豐度與有效磷含量相關。本研究結果表明，西洋參幼苗根際土壤真菌群落結構受西洋參水提液及其連作土壤浸提液影響，其變化與土壤理化性質密切相關。曲霉屬、周刺座霉屬和Cladorrhinum屬等真菌與pH值顯著相關；土壤養分與Cybedindnera屬、Gilmanielta屬和赤霉菌屬等真菌顯著相關：土壤酶活性與木霉屬和被孢霉屬等真菌顯著相關。該結果表明，土壤微生物群落變化與土壤理化性質的改變息息相關，優化土壤理化性質可緩解西洋參的連作障礙。

綜上所述，西洋參水提液及其連作土壤浸提液能夠抑制西洋參的生長，并改變西洋參幼苗根際土壤的理化性質和真菌群落多樣性。研究結果為西洋參連作障礙發生和機理的認識奠定了基礎。