溫膽湯對代謝相關脂肪性肝病小鼠脂質代謝的影響*

李昱芃，臧超越

（1．天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2．天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

代謝相關脂肪性肝病（MAFLD）曾經被稱為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），據(jù)不完全統(tǒng)計，MAFLD是世界肝病患者并發(fā)癥及死亡的主要原因之一[1-3]。近幾十年來，隨著生活水平的不斷提高，人類生活節(jié)奏和飲食習慣發(fā)生明顯改變，使全球MAFLD 的患病率急劇上升[4-5]，因此，MAFLD 已經成為了全球普遍關注的醫(yī)學難題。盡管現(xiàn)代醫(yī)學已經對MAFLD 的病因和分子機制進行了相關的研究，證實脂肪沉積可能是MAFLD 發(fā)病的重要原因[6-7]，但目前為止，國家尚無針對MAFLD 治療的有效藥物批準上市。隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入和發(fā)展，中醫(yī)治療MAFLD 的潛力和優(yōu)勢表現(xiàn)得越發(fā)明顯[8-9]。但是，目前中藥及其有效成分改善MAFLD 脂質代謝的機制研究仍然非常少[10]。而中藥復方溫膽湯具有理氣化痰，清膽和胃的理想功效，并且在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)溫膽湯可通過降低患者肝功能血清酶和血脂等方法治療MAFLD[11-12]，但對于溫膽湯治療MAFLD 的分子藥理機制仍然未知，故在前期研究的基礎上，結合動物和分子生物學實驗，深入探究溫膽湯對MAFLD 小鼠脂質代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用清潔級無菌雄性健康C57BL/6J 小鼠44 只，體質量（22±5）g，所有小鼠均購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0002]。在開始正式實驗前，將小鼠分籠適應性喂養(yǎng)1 周，環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，相對濕度控制在（55±5）%[13]，飼養(yǎng)室每天自然光照12 h，所有小鼠自由飲水，進食，并保持飼養(yǎng)室通風及清潔衛(wèi)生。動物實驗遵循《實驗動物護理和使用指南》，并經過天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準，動物實驗倫理審查號：IACUC of AMMS-04-2020-016。

1.1.2 藥品與試劑 溫膽湯由法半夏12 g，竹茹12 g，枳實12 g，陳皮12 g，茯苓12 g，生姜12 g，灸甘草6 g 等中藥組成，均由天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室提供，按照4∶4∶4∶5∶4∶4∶2 的比例配制。溫膽湯復方煎煮第1 次加10 倍量蒸餾水浸泡30 min，先用大火煎至沸騰后改至小水煎煮，煎煮時間為1 h，將溫膽湯復方過濾，去除藥渣，然后將溫膽湯濃縮至每1 mL 藥液含生藥2 g（即濃度是2 g 原藥材/mL藥液），將溫膽湯經過高壓滅菌冷卻后，置于4 ℃冰箱冷藏備用，在實驗使用時將溫膽湯復方母液稀釋至所需實驗濃度。小鼠的用藥劑量根據(jù)《藥理實驗方法學》中人和動物間的等效計量計算確定[14]。實驗中使用的BCA 蛋白濃度測定試劑盒，丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，均購于上海碧云天生物技術有限公司。實驗中所用的固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、二酰基甘油酰基轉移酶2（DGAT-2）、硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（SCD-1）、脂酰輔酶A 氧化酶（ACO）蛋白抗體均購于武漢博士德生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 全自動血生化分析儀，購自美國貝克曼有限公司；酶標儀和蛋白檢測曝光儀，均購自中國天能儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組 44 只雄性小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為6 組：空白組、模型組、溫膽湯低劑量治療組（低劑量組）、溫膽湯中劑量治療組（中劑量組）、溫膽湯高劑量治療組（高劑量組）、吡咯列酮治療組（吡咯列酮組）。

1.2.2 小鼠MAFLD 模型建立及藥物干預處理 小鼠按自由隨機的方法，分為2 組，空白組8 只，模型組36 只，組間小鼠的體質量和狀態(tài)無統(tǒng)計學差異。空白組給予普通飼料，模型組給予高脂飼料。全部小鼠喂養(yǎng)持續(xù)8 周。8 周后，分別從空白組和模型組的小鼠中隨機挑選1 只，測量其體質量、肝質量，并取2 只小鼠的肝臟組織做病理切片觀察。小鼠MAFLD 造模成功的判定標準為：空白組的小鼠進食生長狀態(tài)正常，皮毛整潔干凈，毛色潤澤，小鼠活動度良好，體質量持續(xù)增長并且無死亡記錄，肝色鮮紅，組織邊緣銳利，質韌；模型組的小鼠反應相對遲鈍，毛色呈灰暗，無光澤，體質量明顯增加，肝外觀呈異常的奶黃色或紅黃相間狀態(tài)，肝臟體積明顯肥大，組織邊緣變鈍，質地變軟，組織切面具有顯著的油膩感，這些特征證實小鼠MAFLD 模型建立成功[15]。

去掉為驗證MAFLD 模型的1 只小鼠，再將模型組其余35 只小鼠隨機分為5 組：模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、吡咯列酮組各7 只。根據(jù)《藥理實驗方法學》中人和動物間等效計量法確定實驗中小鼠的用藥劑量。通過換算發(fā)現(xiàn)，小鼠每日所需的藥物用量=0.052 g/20 g=2.6 g/kg。將此小鼠等效藥物劑量定為中劑量組，低劑量組用藥劑量為中劑量組減半處理即1.3 g/kg，高劑量組用藥劑量為中劑量組2 倍處理即5.2 g/kg。而吡格列酮組按照2.6 mg/kg 處理。各干預治療組小鼠均灌胃給藥處理6 周，每日1 次。灌胃體積為0.01 mL/g。空白組及模型組的小鼠每日灌胃等劑量的蒸餾水。同時，每周對各組小鼠進行稱質量，仔細觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)，體質量，進食情況，毛發(fā)光澤度，糞便情況，活動度，死亡數(shù)量等特征。

1.2.3 樣本采集與處理 從動物造模開始計算，第14 周末當晚將全部小鼠禁食，但不禁水，末次上午將小鼠稱體質量后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定全部小鼠，剖開腹腔，采用真空采血管腹主動脈取血保存，迅速游離并提取小鼠的肝臟組織。用生理鹽水沖洗新鮮的肝臟組織，去除組織薄膜，稱取肝組織濕質量，用于計算小鼠的肝指數(shù)。在小鼠的肝右葉離邊緣1 cm 處，橫切一塊肝組織（取材體積約為3 mm×3 mm×5 mm），用10%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察，剩余肝組織放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｕ婵詹裳艿男迈r血樣于4 ℃靜置2 h后，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，分裝入無菌微型離心管，立即進行小鼠的肝功能和血脂檢測。

1.2.4 HE 染色法觀察肝組織病理形態(tài) 將肝組織切片依次放入二甲苯無水乙醇和75%乙醇中漂洗，進行連續(xù)脫水處理，然后用自來水沖洗。隨后將組織切片放入蘇木素染液漂染5 min，分化液分化，返藍。隨后，將組織切片放入85%和95%的乙醇進行連續(xù)漂洗，各5 min。再放入伊紅染液中漂染5 min。隨后，將組織切片進行脫水透明化處理。最后，采用中性樹膠進行組織切片封片，光學顯微鏡觀察病理切片并采集相應的組織圖像。

1.2.5 全自動生化分析儀測血清轉氨酶及肝臟脂肪含量 檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰基轉移酶（GGT）水平，肝組織的三酰甘油（TG）和總膽固醇（TC）的含量。

1.2.6 比色法檢測MDA 和SOD 水平 BCA 蛋白濃度測定試劑盒用于小鼠肝臟組織的蛋白定量，制作相應的標準曲線，采用丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，用酶標儀和比色法檢測肝組織樣本的MDA 和SOD 的水平。

1.2.7 實時熒光定量（RT-qPCR）法測定脂質代謝重要基因的表達量 取各組小鼠的肝組織100 mg，采用Trizol 法提取小鼠肝組織的總RNA，具體步驟按照組織總RNA 提取試劑盒說明書操作，NanoDrop ND-2000 儀檢測提取的組織總RNA 的濃度及質量，利用Prime-Script RT Enzyme Mix 試劑盒將組織的總RNA 逆轉錄成cDNA，加入PCR擴增反應體系中，運用實時熒光定量PCR 法進行擴增，40 個循環(huán)反應結束后用2-ΔΔCt法進行相對定量的計算和分析，檢測全部目的基因mRNA 的相對表達水平。以β-actin 基因為內參基因，全部基因的RT-qPCR 引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列表Tab.1 Primers used in this study

1.2.8 蛋白質印跡法（Western Blot）測定脂質代謝通路中重要蛋白的表達量 取各組小鼠肝組織100 mg，提取實驗動物的肝組織總蛋白，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒對肝組織總蛋白進行定量。各取60 μg 蛋白樣本進行SDS 凝膠電泳，濕轉膜法進行PVDF 轉膜、5%脫脂牛奶進行封閉、一抗（ACO一抗稀釋比例：1∶500；DGAT2 一抗稀釋比例1∶500；FAS 一抗稀釋比例：1∶800；SCD1 一抗稀釋比例：1∶500；SREBP-1C 一抗稀釋比例：1∶1 000）過夜孵育和二抗（羊抗兔IgG-HRP 二抗稀釋比例：1∶3 000；羊抗小鼠IgG-HRP 二抗稀釋比例：1∶3 000）室溫孵育后，用增強型化學發(fā)光法進行蛋白曝光，蛋白掃描儀掃描蛋白條帶。以GAPDH 蛋白為內參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 24．0 進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間的比較采用單因素分析組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0．05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的整體情況比較 在實驗過程中，所有小鼠均無死亡現(xiàn)象，空白組小鼠飲食情況良好，活動度理想，毛發(fā)光潔亮澤；而模型組小鼠的飲食食欲明顯減退，體質量明顯下降，反應相對遲鈍，活動度下降，毛發(fā)灰暗無光澤。低劑量組、中劑量組、高劑量組和吡咯列酮組小鼠整體情況較模型組有所改善，高劑量組和吡咯列酮組的小鼠整體情況接近于空白組。

2.2 溫膽湯可改善MAFLD 模型小鼠的肝異常指數(shù) 模型組較空白組小鼠的肝異常指數(shù)明顯升高，兩組間比較，差異性具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；各干預治療組與模型組比較，小鼠的肝異常指數(shù)均不同程度的出現(xiàn)降低，并且高劑量組和吡格列酮組的肝異常指數(shù)降低最為顯著，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），提示溫膽湯可明顯改善MAFLD 模型小鼠的肝指數(shù)，并且高劑量的溫膽湯和吡咯列酮療效接近，具有更佳的治療效果。見圖1。

圖1 各組小鼠肝指數(shù)的比較Fig.1 Comparison of liver index in each group

2.3 各組小鼠肝組織病理學變化比較 通過組織病理學的觀察發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠的肝小葉組織結構完整，細胞核分布均勻，且肝細胞大小一致，無明顯的病變；模型組小鼠出現(xiàn)明顯的彌漫性的肝細胞脂肪變性，細胞核分布明顯不均，肝細胞大小不一。各干預治療組與模型組小鼠比較，仍然存在一定程度的脂肪細胞浸潤，但是，脂肪變性程度降低和脂肪空泡化程度降低，其中高劑量組和吡咯列酮組的小鼠肝組織脂肪變性程度最低，脂肪空泡數(shù)量最少。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織病理學變化比較（HE，×100）Fig.2 Comparison of liver histopathological changes in each group(HE，×100)

2.4 溫膽湯可顯著改善MAFLD 模型小鼠的肝功能 通過數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，與空白組小鼠比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP 和GGT 的水平明顯升高，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；各治療組與模型組比較，血清中ALT、AST、ALP 和GGT 水平均有不同程度的降低，其中以高劑量組和吡咯列酮組最為明顯，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。該研究結果提示，溫膽湯可顯著改善MAFLD 模型小鼠的肝功能，并且高劑量的溫膽湯和吡咯列酮的療效接近，具有更佳的治療效果。見圖3。

圖3 各組小鼠肝功能指標的比較Fig.3 Comparison of liver function indicators in each group

2.5 溫膽湯對MAFLD 模型小鼠的肝臟脂肪沉積的影響 通過數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，與空白組小鼠比較，模型組小鼠的TG 和TC 水平明顯升高，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；各治療組與模型組比較，TG 和TC 水平均有不同程度的降低，其中以高劑量組和吡咯列酮組最為明顯，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結果表明，溫膽湯可顯著降低MAFLD 模型小鼠的肝臟脂肪沉積，并且高劑量的溫膽湯和吡咯列酮療效接近，具有更佳的治療效果。見圖4。

圖4 各組小鼠肝臟組織脂肪沉積水平比較Fig.4 Comparison of lipid deposition levels in liver tissues of mice in each group

2.6 溫膽湯對MAFLD 模型小鼠的脂質過氧化水平的影響 通過數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，與空白組小鼠比較，模型組小鼠肝組織丙二醛（MDA）水平明顯升高，SOD 水平明顯降低，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；各干預治療組與模型組比較，肝組織MDA 水平均有不同程度的降低，超氧化物歧化酶（SOD）水平均有不同程度的升高，其中以高劑量組和吡咯列酮組最為明顯，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結果表明，溫膽湯可顯著降低MAFLD 模型小鼠的脂質過氧化水平，改善脂質過氧化損傷，并且高劑量的溫膽湯和吡咯列酮療效接近，具有更佳的治療效果。見圖5。

圖5 各組小鼠肝組織脂質過氧化水平比較Fig.5 Comparison of lipid peroxidation levels in liver tissues of mice in each group

2.7 溫膽湯對MAFLD 模型小鼠的脂質代謝通路重要基因的表達影響 固醇調節(jié)元件結合蛋白1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、二脂酰甘油酰基轉移酶2（DGAT-2）、硬脂酰2 輔酶A 去飽和酶（SCD-1）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因（ACO）均為重要的脂質代謝基因。與空白組小鼠比較，模型組肝組織的所有脂質代謝通路重要基因的表達水平均升高，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；各治療組與模型組比較，肝組織的所有脂質代謝通路重要基因的表達水平均有不同程度的降低，其中以高劑量組和吡咯列酮組最為明顯，差異性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。該研究結果提示，溫膽湯可顯著降低MAFLD 模型小鼠的的脂質代謝重要基因的表達水平，并且高劑量的溫膽湯和吡咯列酮療效接近，具有更佳的治療效果。見圖6。

圖6 各組小鼠脂質代謝重要基因表達水平比較Fig.6 Comparison of the expression levels of important genes in lipid metabolism in each group

2.8 溫膽湯對MAFLD 模型小鼠的脂質代謝重要蛋白的表達影響 通過數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，與空白組小鼠比較，模型組小鼠肝組織的所有脂質代謝重要蛋白的表達水平均升高，差異性均具有統(tǒng)計學意義；各治療組與模型組比較，肝組織的所有脂質代謝重要蛋白的表達水平均有不同程度的降低，其中以高劑量組和吡咯列酮組最為明顯，差異性均具有統(tǒng)計學意義。結果表明，溫膽湯可顯著降低MAFLD 模型小鼠的的脂質代謝重要蛋白的表達水平，并且高劑量的溫膽湯和吡咯列酮療效接近，具有更佳的治療效果。見圖7。

圖7 各組小鼠脂質代謝重要蛋白表達水平比較Fig.7 Comparison of the expression levels of important proteins in lipid metabolism in each group

3 討論

在西醫(yī)學治療中，MAFLD 通常是在病因針對性治療、飲食調理性治療、運動及心理治療和行為修正治療的基礎上，采用患者保肝處理，并督促患者堅持服用降酶、降脂藥物，促進患者肝內脂肪沉積和炎癥的逐漸消失，對于MAFLD 患者的肝細胞壞死和肝纖維化具有一定的療效[16-17]。但遺憾的是，迄今為止，并無治療MAFLD 的針對性特效臨床藥物。故國內外不少專家學者冀希望于利用中醫(yī)辨證論治來尋求治療MAFLD 的新方法和新藥物[18-19]。雖然經過幾代人的努力，中藥治療MAFLD 取得了一定程度的進展，但目前中藥及其有效成分改善MAFLD脂肪沉淀和脂質代謝的分子機制尚不清楚[20]。該研究為中藥治療MAFLD 提供了很好的研究依據(jù)。在中醫(yī)研究中，針對MAFLD “痰，濕，瘀，積”這一基本的臨床病理[21]，應用理氣化痰、清膽和胃的溫膽湯，取得理想的臨床治療效果，但溫膽湯治療MAFLD 的具體分子機制仍是未知的。因此，團隊在前期溫膽湯治療MAFLD 的臨床研究基礎上進行了深入探究。通過動物和分子生物學實驗，以脂質代謝角度為切入點，提出“溫膽湯可以預防肝脂肪變性，抑制血清中脂肪，磷脂，過氧化脂質，調節(jié)肝內膽固醇，調節(jié)脂肪代謝來保護肝細胞，促進肝臟的修復，總而言之，溫膽湯通過調節(jié)脂質代謝，進而產生MAFLD 治療效應”的科學假說[22-23]，探索并明確溫膽湯治療MAFLD 小鼠的最佳藥物劑量，進一步揭示溫膽湯治療MAFLD 的潛在分子機制，將有助于明確中醫(yī)藥治療MAFLD 的作用機制和臨床應用的可能，對于臨床防治MAFLD 具有重要的理論價值和臨床意義，對中藥新藥的開發(fā)有積極作用和推動效應，為MAFLD 患者的早期康復帶來福音。

團隊前期的研究發(fā)現(xiàn)在動物模型及脂肪肝患者中，肝組織的脂質過氧化水平是明顯增加的。目前，人體內的游離脂肪酸通常被認為是脂肪肝患者激活氧化應激的直接來源，且與肝臟疾病的嚴重程度是成正相關的。因此，患者肝組織的MDA 和SOD含量是反映MAFLD 患者抗氧化能力和水平的重要參數(shù)，通過MDA 和SOD 含量可以有效反映機體的氧化應激的程度，更能間接反映患者肝組織過氧化的損傷程度[24]。該研究通過對小鼠的檢測，發(fā)現(xiàn)溫膽湯可以明顯改善肝組織的過氧化損傷，進一步揭示了溫膽湯通過調節(jié)脂質代謝治療MAFLD 患者的分子機制。

SREBP-1c，F(xiàn)AS，DGAT22 和SCD1 都是機體內脂質代謝通路的重要因子，調控機體內脂質合成。目前的研究表明，機體內的脂質過量合成或者脂質代謝異常可能是MAFLD 的主要致病因素。研究通過RT-qPCR 和Western Blot 實驗，從分子和蛋白水平證實了溫膽湯對MAFLD 的治療作用存在明顯的劑量依賴性。而中劑量和高劑量組可以明顯抑制脂質合成基因SREBP-1c，F(xiàn)AS，DGAT22 和SCD1 的表達，并且高劑量組與陽性藥吡格列酮的治療效果幾乎一致，但是，吡格列酮的不良反應很大，MAFLD患者長時間服用可能會造成患者水腫，上呼吸道感染，頭痛，咽炎，鼻竇炎或者低血糖等癥狀，對于MAFLD 患者的治療和身體恢復存在明顯弊端，而溫膽湯在臨床中的不良反應很小且治療效果理想，因此，認為溫膽湯治療MAFLD 可以成為未來的主要治療策略。

長時間的飲用高脂飼料促進MAFLD 發(fā)生發(fā)展的主要機制為高脂進一步紊亂小鼠機體的脂質代謝，導致MAFLD 的發(fā)生發(fā)展。該研究經不同劑量的溫膽湯進行藥物干預治療后，小鼠肝細胞脂肪變性均有一定程度的減輕，各干預治療組小鼠肝細胞結構排列更加整齊，脂滴和空泡化明顯減少，肝異常指數(shù)明顯下降，血清轉氨酶及肝臟脂肪水平顯著降低，過氧化物MDA 水平明顯降低，SOD 的水平明顯升高，脂質代謝重要基因和蛋白的表達水平明顯下調。溫膽湯可以明顯減輕MAFLD 小鼠肝損傷及脂質沉積，可能與調節(jié)小鼠體內脂質過氧化水平和脂質代謝重要基因和蛋白的表達水平，降低MDA 水平，提高SOD 水平有關，這一新的分子作用機制有望為MAFLD 的臨床治療提供一種全新的治療理論和治療選擇。