補陽還五湯通過干預腸道菌群改善阿司匹林致消化道損傷作用及機制研究*

路美娟，楊培麗，劉毅

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院心血管內科，天津 300250；2.天津中醫藥大學研究生院，天津 301617）

阿司匹林、氯吡格雷等傳統抗血小板藥物通過抑制血小板活化、聚集等功能發揮抗血小板作用，是心腦血管疾病的一、二級預防用藥[1]。但這些藥物往往伴隨不同程度的消化道損傷和出血事件，包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍、糜爛性胃炎、慢性淺表性胃炎等，使許多患者無法耐受[2]。這些不良反應與藥物破壞胃黏膜保護屏障、增加黏膜出血風險、增加細胞毒性物質形成等機制有關[3]。研究發現一些活血化瘀類中藥及復方具有抗血小板和改善消化道黏膜損傷的雙重作用[4]，或許能達到抗血栓形成與防治出血的潛在平衡。補陽還五湯為氣血雙調經典方劑，攻補兼施，臨床上聯合傳統抗血小板藥物防治心腦血管疾病效果明顯[5]。方中赤芍、川芎、紅花等活血藥可通血脈之瘀滯，具有抗血小板聚集、調節脂質代謝、降低血管阻力等作用[6]。而且補陽還五湯重用黃芪補正氣之虛，使祛瘀而不傷正。現代藥理研究顯示黃芪具有保護腸黏膜、抗炎、調節免疫、修復黏膜損傷等作用[7]，提示補陽還五湯在發揮抗血小板作用的同時兼有保護消化道黏膜之效。

許多研究證實腸道菌群是阿司匹林類抗血小板藥物引起腸道炎癥的關鍵因素，通過參與肝腸循環和激活先天免疫系統，在腸道損傷和修復中發揮雙重作用，可以作為修復抗血小板藥所致腸道損傷的切入點[8]。中藥因其多種類、多成分、多靶點等特點發揮對腸道菌群的調節作用，可通過調節腸道菌群豐富度和多樣性穩態，保護消化道結構和功能的穩定[9]。鑒此，該研究通過對比補陽還五湯與西醫傳統抗血小板藥物以及活血化瘀經方——血府逐瘀湯的抗血小板功效，探究補陽還五湯的“祛瘀之力”；另一方面，從腸道菌群入手，探討補陽還五湯對阿司匹林誘導的消化道損傷模型大鼠腸道菌群的影響，明確補陽還五湯“扶正之功”用于改善消化道損傷的效果及作用機制，以期為傳統抗血小板藥物不耐受患者提供安全有效的用藥方案。

1 材料

1.1 動物 75 只體質量在200～220 g 的SPF 級健康雄性SD 大鼠，于北京華阜康生物科技股份有限公司購買，合格證號為SCXK（京）2019-0008；飼養于溫度（25±2）℃、濕度50%～65%的SPF 級實驗動物房，喂養普通飼料。

1.2 主要藥物與試劑 補陽還五湯、血府逐瘀湯按原方配伍于天津中醫藥大學第二附屬醫院購買；阿司匹林（上海源葉生物，批號：J07J11Q107646），硫酸氫氯吡格雷片[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：ca683]，大鼠水合氯醛（天津易生源，批號：2021S922），羧甲基纖維素鈉（上海源葉生物，批號：Y24S11x12），4%組織細胞固定液（天津易生源，批號：20211201001），PBS 緩沖液（北京索萊寶，批號：20211124）。

1.3 主要儀器 電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司，型號：STX123ZH]，液氮罐（東亞，型號：YDS-30L），低溫高速離心機（北京新時代北利醫療儀器設備有限公司，型號：GTR16-2），DNA 提取試劑盒（型號M5636-02，廣州飛揚生物），PCR 擴增儀（型號2702，賽默飛世爾科技），酶標儀（型號FLx800，公司BioTek）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥方法 適應性喂養1 周后，按隨機數表法分為對照組、模型組、補陽還五湯組、血府逐瘀湯組、雙抗組，每組15 只，分組方法使用隨機數表法，組內編號，稱質量給藥。除對照組外其余4 組制備阿司匹林所致消化道損傷模型。造模方法：通過查閱資料，分別使用10.41、50、300 mg/kg 阿司匹林制劑進行預實驗，以大鼠出現便潛血陽性、腸黏膜組織病理切片出現結構破壞和炎癥反應為造模成功的判斷標準，選出制備消化道損傷模型最適宜的劑量，最終以300 mg/kg 阿司匹林制劑灌胃給藥制備模型。每日上午，除對照組灌胃生理鹽水外，其余各組灌胃阿司匹林制劑300 mg/kg，每日1 次；每日下午，補陽還五湯組、血府逐瘀湯組、雙抗組分別灌胃相應藥物，補陽還五湯給藥劑量為12.2 g/kg；血府逐瘀湯給藥劑量為6.5 g/kg；氯吡格雷給藥劑量為6.5 mg/kg，每日1 次，給藥體積均為10 mL/kg，共計2 周。

2.2 檢驗指標及方法

2.2.1 體質量變化 每日上午灌胃前記錄大鼠體質量，通過計算實驗前后大鼠體質量變化差值獲得體質量增加量。

2.2.2 消化道出血 于當日上午灌胃前收集大鼠糞便，采用膠體金法檢測便隱血。

2.2.3 體外凝血時間測定 末次給藥1 h 后，用斷尾法測定大鼠體外凝血時間。

2.2.4 血清花生四烯酸（AA）、血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、血栓素B2（TXB2）測定 禁食不禁水12 h，無菌操作收集各組大鼠糞便于離心管中，置于液氮保存。取眼內眥血3 mL 左右后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血。用酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）法分別檢測大鼠血清AA、GPⅡb/Ⅲa、TXB2，具體操作步驟按照說明書進行。

2.2.5 腸黏膜病理組織學檢查 糞便、血液采集后剖腹，取各組大鼠相同部位同等面積的回腸組織，置于4%組織細胞固定液中固定，然后進行石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。顯微鏡下觀察各組大鼠回腸黏膜形態結構差異，并拍照。

2.2.6 腸道菌群多樣性檢測 取對照組、模型組、補陽還五湯組、血府逐瘀湯組大鼠糞便樣品，每組6 只，依據說明使用試劑盒提取總DNA，擴增16SrDNA 的V3-V4區，引物序列為：上游ACTCCTACGGGAGGC AGCA，下游GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴增產物用Quant-iT 染色，酶標儀進行定量。再將純化的擴增產物進行等量混合，加上測序儀所需的接頭、測序引物和index 序列，構建文庫。使用IlluminaHiSeq2500 PE 250 測序平臺進行上機測序，然后按照index 和Barcode 信息，將通過初篩的原始序列進行劃分，并去除barcode 序列；按照QIIME2 dada2 分析流程進行序列去噪。使用R 語言進行數據統計分析。

2.3 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件統計分析。計量資料符合正態用均數±標準差（±s）描述，采用單因素方差分析；不符合正態用中位數[M（QL，QU）]描述，數據采用非參數檢驗。計數資料用百分率（%）描述，組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠體質量變化 實驗前后，每組大鼠體質量增加量明顯不同（P＜0.05），與對照組相比，模型組大鼠體質量增加量明顯降低（P＜0.01）；補陽還五湯組體質量增加量（70.27±15.42）g 與模型組（57.50±23.73）g、血府逐瘀湯組（65.79±18.70）g、雙抗組（64.64±18.22）g 的體質量增加量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化Fig.1 Weight change of rats in each group

3.2 消化道出血陽性率 模型組便潛血陽性率為46.7%，證明造模成功。經卡方檢驗發現，各組之間消化道出血陽性率比較著差異有統計學意義（χ2=23.219，P＜0.01）。進一步組間比較發現，與對照組相比，模型組、血府逐瘀湯組、雙抗組便潛血陽性率降低（P＜0.01）；與雙抗組相比，補陽還五湯組便潛血陽性率降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠消化道出血陽性率Tab.1 Positive rate of gastrointestinal bleeding in rats in each group

3.3 體外凝血時間 與對照組相比，模型組和雙抗組體外凝血時間明顯延長（P＜0.05）；補陽還五湯組凝血時間與對照組延長，較模型組、血府逐瘀湯組及雙抗組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組體外凝血時間（±s）Tab.2 In vitro coagulation time of each group（±s） s

表2 各組體外凝血時間（±s）Tab.2 In vitro coagulation time of each group（±s） s

注：對照組比較，*P＜0.05。

組別動物數凝血時間對照組13238.38± 39.07模型組12414.58±158.57*補陽還五湯組13271.85± 59.05血府逐瘀湯組12302.58± 80.54雙抗組12416.75±175.10*

3.4 各組大鼠AA、TXB2、（GP）Ⅱb/Ⅲa 含量差異 與模型組相比，雙抗組AA 含量顯著降低（P＜0.01），補陽還五湯組、血府逐瘀湯組AA 含量差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，雙抗組TXB2 含量降低（P＜0.05），補陽還五湯組、血府逐瘀湯組差異無統計學意義（P＞0.05）；與雙抗組相比，補陽還五湯組、血府逐瘀湯組AA 含量顯著增加（P＜0.01）；與對照組相比，補陽還五湯組、模型組GPⅡb/Ⅲa 含量顯著降低（P＜0.01）；與雙抗組相比，補陽還五湯組GPⅡb/Ⅲa 含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠AA、TXB2、GPⅡb/Ⅲa 含量Tab.3 AA，TXB2，GPⅡb/III.a contents of rats in each group ng/mL

3.5 各組大鼠腸黏膜結構影響 對照組腸黏膜結構基本正常，絨毛規則排列，完整無缺損；其余各組結構異常，有炎性細胞浸潤，絨毛形態不規則，伴有不同程度缺失，并且間質可見水腫和出血。其中以雙抗組和血府逐瘀湯組腸黏膜結構缺失及炎性反應最嚴重；與其他處理組對比，補陽還五湯組損傷最小、炎性細胞浸潤最輕。見圖2。

圖2 光鏡下各組腸黏膜組織病理切片（HE，×100）Fig.2 Pathological sections of intestinal mucosal histopathology in each group under light microscopy(HE，×100)

3.6 腸道菌群多樣性檢測

3.6.1 各組大鼠腸道菌群整體變化的影響 使用主坐標分析（PCoA），研究各個樣本間的組成距離關系。如圖3A 所示，各組樣本PCoA 分析結果顯示各組區分明顯，表明阿司匹林和補陽還五湯干預可顯著影響腸道菌群的豐度和結構。使用韋恩圖展示分組之間的操作分類單元（OTU），即OTU 的共有或者特有信息。根據圖3B 可知，對照組、模型組、補陽還五湯組、血府逐瘀湯組總OTU 數分別為8 032、12 369 、5 927、5 118。

圖3 各組大鼠腸道菌群整體變化Fig.3 Overall changes of intestinal flora in each group

3.6.2 各組大鼠腸道菌群多樣性的影響 如圖3C所示，Chao1 表示預測的OTU 個數，Simpson 指數、Shannon 指數與群落多樣性成正相關。結果見表4，各組數據方差不齊，使用Kruskal-Wallis 秩和檢驗作為檢驗。如圖3C 所示，Alpha 多樣性表明，各組大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性存在差異（P＜0.05）；與模型組相比，血府逐瘀湯組Chao1、Simpson、Shannon 指數均顯著降低（P＜0．05）。見表4。

表4 各組樣品菌群多樣性指數結果（±s）Tab.4 Results of microbiota diversity index of each group（±s）

表4 各組樣品菌群多樣性指數結果（±s）Tab.4 Results of microbiota diversity index of each group（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別動物數Chao1SimpsonShannon對照組62 038.00±65.37 0.977 9±0.002 9 7.793 5±0.1402模型組63 177.03±550.30 0.983 2±0.004 6 8.438 3±0.4428補陽還五湯組61 906.57±117.15 0.971 6±0.004 7 7.186 6±0.2972血府逐瘀湯組61 666.10±24.29* 0.952 7±0.007 0 6.732 3±0.1350*

3.6.3 各組大鼠腸道菌群結構組成與差異性分析

3.6.3.1 門分類水平 如圖4 所示，在門水平豐度前20 的物種中，各組優勢菌群（排在前3 位，占比90%以上）均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria），其中厚壁菌門的占比最大，其次是擬桿菌門。采用t 檢驗尋找組間差異顯著的物種。如圖5 所示，與對照組對比，模型組柔膜菌門（Tenericutes）顯著下降，螺旋體門（Spirochaetes）顯著上升；與模型組相比，補陽還五湯組擬桿菌門顯著上升，厚壁菌門顯著下降；與模型組，血府逐瘀湯組擬桿菌門顯著上升。各組中厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值（即F/B 值）由低到高依次為：補陽還五湯組（0．676）＜血府逐瘀湯組（1．025）＜模型組（3．461）＜對照組（3．619）。

圖4 各組門水平物種分布堆疊圖Fig.4 Stacked horizontal species distribution of each group of phyla

圖5 各組差異菌門Fig.5 Differential phylums for each group

3.6.3.2 屬分類水平 如圖6 所示，在屬水平豐度前20 的物種中，對照組中瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（15．92%）豐度最高，其次為乳桿菌屬（Lactobacillus）（13．47%）、S24-7 菌屬（13．02%）、毛螺菌屬（Lach nospiraceae）（9．3%）。模型組中乳桿菌屬（15．58%）豐度最高，其次為S24-7 屬（14．89%）、瘤胃球菌屬（9．55%）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）（7．67%）。補陽還五湯組中普氏菌屬（Prevotella）（37．37%）豐度最高，其次為乳桿菌屬（19．59%）、S24-7 菌屬（17．00%）、梭菌屬（6．67%）。血府逐瘀湯組中占比最高的為乳桿菌屬（29.50%），其次為普氏菌屬（28.09%）、S24-7菌屬（15.06%）、瘤胃球菌屬（5.05%）。

圖6 各組屬水平物種分布堆疊圖Fig.6 Horizontal species distribution stacked by genera group

使用LEfSe 分析挖掘各組間屬水平之間的差異，如圖7 所示，與對照組對比，模型組有4 個菌屬表現出顯著差異，Allobaculum、梭桿菌屬（Fusobacterium）顯著增加，顫螺旋菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬顯著下降。如圖8 所示，與模型組對比，補陽還五湯組普氏菌屬、紅球菌屬（Rhodococcus）、韋榮氏菌屬（Veillonella）顯著上升，瘤胃球菌屬、丹毒絲菌屬（Holdemania）、02d06、Adlercreutzia、Anaerotruncus、Blautia 顯著下降。如圖9 所示，與模型組對比，血府逐瘀湯組普羅維登斯菌屬（Providencia）、乳桿菌屬、紅球菌屬、Odoribacter、普氏菌屬顯著上調，Adlercreutzia、Blautia、瘤胃球菌屬顯著下降。

圖7 對照組與模型組兩組間菌群顯著差異圖Fig.7 Significant differences in microbiota between the control group and the model group

圖8 模型組與補陽還五湯組兩組間菌群顯著差異圖Fig.8 Significant differences in microbiota between the model group and the five decoction groups

圖9 模型組與血府逐瘀湯組兩組間菌群顯著差異圖Fig.9 Significant differences in microbiota between the model group and the Xuefu Zhuoyu Decotion group

4 討論

4.1 補陽還五湯的抗血小板效果 血小板活化和聚集等功能異常是心腦血管疾病發生的關鍵因素，血小板功能相關指標GPⅡb/Ⅲa、AA、TXB2 可以用于評價疾病的危險程度[10]。既往研究發現，補陽還五湯可以明顯降低高脂血癥大鼠血液黏度水平，同時減少血漿TXB2 的形成發揮抗血小板作用，用于防治血栓形成[11]。研究結果顯示，補陽還五湯組AA、TXB2 含量較模型組有降低趨勢，這與既往實驗相符，提示補陽還五湯可抑制AA、TXB2 活性達到一定抗血小板聚集效果，但由于樣本量較少，未能明確具體差異程度。另外，研究發現與血府逐瘀湯組和對照組相比，補陽還五湯組GPⅡb/Ⅲa 的含量顯著降低，GPⅡb/Ⅲa 含量與血小板活化密切相關，纖維蛋白原交聯GPI 形成穩定的凝塊常作為血小板聚集的最終途徑，因此，抑制GPⅡb/Ⅲa 活性可有效抑制血小板聚集[12]。這證實補陽還五湯具有抗血小板聚集作用，可增強阿司匹林的功效，也提示與GPⅡb/Ⅲa 相關的血小板聚集途徑可能是補陽還五湯發揮抗血小板功能的靶點。

機體凝血系統與抗凝系統之間的協調平衡保證血液正常運行，任意一方失調都會造成血栓形成或出血風險。傳統抗血小板藥物通過抑制血小板活化防治血栓，往往會造成抗凝系統相對亢進增加出血風險。研究發現補陽還五湯組凝血時間較對照組延長，較模型組、雙抗組、血府逐瘀湯組縮短，表明相較于傳統抗血小板藥物，補陽還五湯聯合阿司匹林在發揮抗血小板作用的同時，能夠降低出血風險，提示補陽還五湯與阿司匹林聯合應用可以達到抗血栓形成與防止出血之間的潛在平衡。

4.2 補陽還五湯通過影響腸道菌群物種豐富度與多樣性改善消化道損傷 阿司匹林通過抑制血小板活化的AA 途徑發揮抗血小板作用，廣泛應用于心腦血管疾病防治，但長期服用阿司匹林使患者發生消化道出血的風險約增加0.3%[13]。實驗使用高劑量阿司匹林灌胃給藥，同時給予補陽還五湯、血府逐瘀湯、氯吡格雷干預，通過對比各組之間消化道黏膜的損傷程度，從而突出補陽還五湯的治療效果。結果顯示，補陽還五湯組便潛血陽性率明顯降低，證實補陽還五湯干預后，削弱了阿司匹林對消化道的損傷，證實補陽還五湯對阿司匹林導致的消化道損傷具有顯著的改善作用。

服用抗血小板藥物導致消化道出血的患者需要及時使用質子泵抑制劑（PPI）等進行修復黏膜和抑酸治療，但研究表明PPI 雖然可以改善抗血小板藥物引起的消化道癥狀，同時也削弱了抗血小板作用并增加血栓事件發生率，而補氣活血類中藥既可以抑制血小板活化又能保護消化道黏膜、減輕局部炎癥反應[14]。研究發現除對照組外，補陽還五湯組大鼠體質量增加量最大，這可能與進食量多有關，反映補陽還五湯組大鼠食欲好、消化道不良反應相對較輕，進一步對比各組大鼠腸黏膜病理切片發現，補陽還五湯組腸道黏膜損傷最輕，組織結構相對完整，細胞排列規則、境界清楚，炎性程度最小，證實補陽還五湯對消化道黏膜有一定保護和修復作用，對于有消化道癥狀的心血管疾病患者，配合補陽還五湯進行抗血小板治療是一個新選擇。

以細菌為主的腸道微生態系統也被稱為腸道菌群。根據與宿主之間的關系，腸道菌群主要分為有益菌、致病菌、過路菌，它們通過調節免疫、代謝、結構和神經系統，共同維持著腸道內外環境的穩態[15]，而當消化道損傷時又會影響菌群的種類、數量、代謝等。因此，腸道菌群常常作為切入點，用于探究消化道疾病發生發展進程中的具體機制和治療靶點。腸道微生態的穩定與腸道菌群比例的動態平衡有關，與益生菌種類和數量無關，如果益生菌的過度增殖反而會對機體造成傷害。腸道菌群多樣性和OTU 分析表明，各組大鼠糞便優勢菌群均為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，這與正常人類腸道優勢菌門相似[16]。進行阿司匹林干預后，模型組大鼠腸道菌群物種豐富度與多樣性上升，這一結果與此前的一項研究結果相對應，服用非甾體抗炎藥的老年人的微生物總數高于未服用非甾體抗炎藥的個體[17]。提示阿司匹林可能通過影響腸道菌群物種豐富度與多樣性，進而導致腸道代謝紊亂、破壞腸道微生態，引起消化道損傷。同時，研究發現服用補陽還五湯后，菌群物種豐富度與多樣性下降，恢復至與正常類似的水平，這可能是補陽還五湯發揮消化道黏膜保護作用的原因，但需進一步結合豐富度和多樣性的變化進行分析。

從門水平對大鼠腸道菌群豐富度和多樣性的變化分析，發現補陽還五湯治療后擬桿菌門顯著上升，厚壁菌門明顯下降。擬桿菌門和厚壁菌門占腸道菌群總數的90%以上，與機體能量代謝、脂肪存儲等過程密切相關。其中，擬桿菌門是健康腸道中的益生菌群，可以為身體提供營養，并參與機體代謝、免疫等過程[18]。另有研究發現[19]，當消化道出現炎癥反應及病理損傷時，厚壁菌門有增加趨勢，提示腸道損傷可能與厚壁菌門增加有關。因此，F/B 值被認為是反應菌群紊亂的重要參數，該比值越低則腸道菌群越穩定。各組中，補陽還五湯組值為0.676，明顯低于模型組的3.461，基于實驗結果，推測模型組大鼠腸道厚壁菌門與擬桿菌門的豐度比值降低，可能是阿司匹林導致消化道損傷重要因素，補陽還五湯通過調整腸道細菌比例失衡在一定程度上改善消化道損傷。

從屬水平進行分析，發現經過補陽還五湯干預后，普氏菌屬、乳桿菌屬等有益菌顯著上調并占主要優勢，這與相關報道相一致[20]。普氏菌屬和乳桿菌屬能抑制有害微生物生長，產生短鏈脂肪酸，發揮抗炎、保護消化道黏膜、調節激素分泌和腸道免疫反應等作用[21]。另外，與對照組相比，補陽還五湯治療后屬水平上瘤胃球菌屬顯著降低，瘤胃球菌屬于厭氧菌，與短鏈脂肪酸產生同樣有關，可以保護腸黏膜正常的結構和功能，并有抗炎作用，因此瘤胃球菌有助于控制消化道損傷，該實驗結果與理論情況不一致，筆者推測可能是測序誤差，而且腸道菌群是一個微生態系統，重點并不在于某類菌屬的多少，而在于維系整個系統的動態平衡。

5 結論

研究發現補陽還五湯能顯著降低大鼠血清GPⅡb/Ⅲa 水平，同時降低AA、TXB2 水平，證實補陽還五湯具有抗血小板作用GPⅡb/Ⅲa 含量顯著降低提示與GPⅡb/Ⅲa 相關的血小板聚集途徑可能是補陽還五湯發揮抗血小板功能的靶點；另外，研究發現補陽還五湯可以降低阿司匹林導致的消化道出血風險，保護并修復消化道黏膜損傷，這一作用可能與影響消化道菌群的豐富度和多樣性、調整腸道細菌比例失衡有關。補陽還五湯不僅具有抗血小板作用，也能保護消化道黏膜。與傳統抗血小板藥物聯用，既能到達與雙抗藥物類似的抗血小板效果，又能降低傳統抗血小板藥物的不良反應，為心腦血管疾病提供新的用藥方案。但是該研究上有不足之處：體質量增加指數、AA、TXB2 水平等指標呈明顯改善趨勢，但統計學意義不明顯，考慮與樣本量不足有關；此外，腸道菌群檢測的樣本量也較少，需進一步探究。