運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桑麻止咳湯治療西北燥證兼慢性支氣管炎的作用機(jī)制*

祝嘉健，張悅琳，胡雪紅，周銘心，甄賢杰，鄭春燕，鄧茹雪，姜廣建，姜德

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830011）

西北燥證是以新疆為代表的西北地區(qū)，受到燥邪侵襲，從而表現(xiàn)出口鼻、咽喉、肌膚干燥和干咳、煩躁等癥狀的一組中醫(yī)證候。該組證候是新疆地區(qū)人群亞健康狀態(tài)的特征性表現(xiàn)。可影響過敏性鼻炎、咽炎、支氣管炎、皮膚瘙癢等多種疾病[1]。

慢性支氣管炎（CB）屬于慢性非特異性炎癥，其病位在氣管、支氣管黏膜及周圍組織。作為一種臨床診斷，主要以慢性咳嗽、咳痰為特征。CB 發(fā)生發(fā)展的首要病因是吸煙，其次為粉塵、煙霧、有害氣體的吸入等[2]。細(xì)菌和病毒的感染也是發(fā)病的重要因素之一。在臨床方面，主要依據(jù)患者的情況，分期進(jìn)行治療。同時(shí)，中醫(yī)藥也發(fā)揮了很大的作用，方劑、針刺、貼敷等有較好療效[3]。

中醫(yī)學(xué)將慢性支氣管炎歸屬于“咳嗽”等范疇。“咳嗽”首先記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，并指出病位在肺[4]。桑麻止咳湯是全國名中醫(yī)周銘心治療慢性支氣管炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著。桑麻止咳湯由桑白皮、炙麻黃、黃芩、魚腥草、前胡、川貝母（伊貝母）、紫菀、款冬花、炙甘草9 味藥組成。慢性支氣管炎以肺失宣肅為主要證候。凡肺氣宣肅不利，勢必停痰而郁熱。故其治療要在宣肅肺氣，清熱化痰，務(wù)使肺體清虛。該方即以此宗旨而設(shè)。方委麻黃為君，以其能宣能肅，最為肺家主將。用桑白皮、前胡，或宣或肅，俱善梳理肺氣，故以為臣；復(fù)用黃芩、魚腥草以清肺中熱邪郁火，伊貝母、紫苑、款冬花以化其痰濁蘊(yùn)結(jié)，并為佐藥；后用炙甘草，既可祛痰止咳而為佐，又能調(diào)和藥性而為使。諸藥合和，使肺體清爽，氣得宣降，舊宿之邪從而驅(qū)除，欲侵之邪無由而入，則其病乃愈。臨證時(shí)依據(jù)病癥不同，取上述方藥為主而做適當(dāng)加減。咳嗽痰白，而兼惡寒無汗，鼻塞清涕者，加羌活、蘇葉、白芷；咳嗽痰黃，而兼發(fā)熱口渴，苔黃脈數(shù)者，加桑葉、生石膏、知母；咳嗽痰多，而兼胸脘滿悶，苔白膩者，加半夏、陳皮、茯苓。至于兼有肝火從證者，加青黛（布包）、梔子，兼有陰虛從證者，加沙參、百合。

韓榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用西北燥證經(jīng)驗(yàn)方藥治療攜證型慢性支氣管炎，不僅對西北燥證有較好改善，而且對慢性支氣管炎病情改善也優(yōu)于普通治療。基于桑麻止咳湯治療西北燥證兼CB 的臨床療效，故該研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討桑麻止咳湯治療西北燥證兼CB 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 中藥成分及靶點(diǎn)信息收集 在本草組鑒（HERB）數(shù)據(jù)庫（http：//herb．a(chǎn)c．cn/）中檢索桑白皮，炙麻黃，黃芩，魚腥草，前胡，川貝母，紫菀，款冬花，炙甘草，收集其化學(xué)成分，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem．ncbi．nlm．nih．gov/）檢索其化學(xué)結(jié)構(gòu)，將化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissADME 數(shù)據(jù)庫（http：//www．swissadme．ch/）預(yù)測成分的化學(xué)性質(zhì)，對所有成分進(jìn)行篩選，活性成分需同時(shí)滿足以下條件：1）胃腸吸收（GI absorption）為“High”。2）5 種類藥性預(yù)測（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結(jié)果中有2 個(gè)及2 個(gè)以上為“Yes”。活性成分的靶點(diǎn)通過SwissTargetPrediction 平臺(tái)（http：//www．swisstargetprediction．ch/）獲取，設(shè)置物種為“homo sapiens”，篩選條件為Probability＞0。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選 以“Chronic Bronchitis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https：//www．genecards．org/）中進(jìn)行檢索，以Relevance score＞1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件Venny 2．1，得到交集靶點(diǎn)，作為藥物治療疾病的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。將交集靶點(diǎn)提交至STRING（https：//string-db．org）數(shù)據(jù)庫，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“high confidence”（＞0．7）并剔除游離的靶點(diǎn)，再導(dǎo)出數(shù)據(jù)通過Cytoscape 3．7．1 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥PI 網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表靶基因，連線代表靶基因之間相互作用；節(jié)點(diǎn)越大表示靶點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的Degree 值越大，顏色由冷色到暖色漸變表示Degree 值由小到大。

1.4 基因本體（GO）生物學(xué)過程和京都基因與基因組百科（KEGG）信號(hào)通路富集分析 將交集靶點(diǎn)運(yùn)用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）進(jìn)行GO 生物學(xué)過程分析，以P＜0．05 和Benjamin 值＜0．05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)。GO 富集分析包括生物學(xué)程（BP），細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）3 個(gè)方面。將交集靶點(diǎn)運(yùn)用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）進(jìn)行京都基因與KEGG 信號(hào)通路富集分析，以P＜0．05 和Benjamin值＜0．05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.5 中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了更好的理解中藥、成分與其相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，將中藥復(fù)方、中藥、中藥成分、治療疾病以及作用靶點(diǎn)構(gòu)建方劑-中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫得到桑麻止咳湯成分的3D 結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www．rcsb．org/）下載靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，使用AutodockTools 1．5．7 軟件分別對小分子和靶蛋白進(jìn)行加氫、去電荷等前處理，借助PyMOL 2．5．2 軟件插件找到對接活性位點(diǎn)，即可在Autodock Vina 1．2．0 軟件將處理后的成分與靶蛋白進(jìn)行分子對接，最后通過PyMOL 2．5．2 軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 桑麻止咳湯有效成分和靶點(diǎn)信息 經(jīng)過檢索和匯總，桑白皮獲得72 個(gè)化學(xué)成分，657 個(gè)靶點(diǎn)；炙麻黃獲得6 個(gè)化學(xué)成分，165 個(gè)靶點(diǎn)；黃芩獲得68 個(gè)化學(xué)成分，566 個(gè)靶點(diǎn)；魚腥草獲得14 個(gè)化學(xué)成分，342 個(gè)靶點(diǎn)；前胡獲得45 個(gè)化學(xué)成分，660 個(gè)靶點(diǎn)；川貝母獲得62 個(gè)化學(xué)成分，714 個(gè)靶點(diǎn)；紫菀獲得23 個(gè)化學(xué)成分，465 個(gè)靶點(diǎn)；款冬花獲得32 個(gè)化學(xué)成分，557 個(gè)靶點(diǎn)；炙甘草獲得5 個(gè)化學(xué)成分，226 個(gè)靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)刪重匯總后得到287 個(gè)藥物成分，1 147 個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 慢性支氣管炎靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到CB 相關(guān)靶點(diǎn)213 個(gè)。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 通過Venny 2．1．0 平臺(tái)得到桑麻止咳湯與CB 的交集靶點(diǎn)117 個(gè)，見圖1。

圖1 桑麻止咳湯和CB 的交集靶點(diǎn)Fig.1 Intersection target of Sangma Zhike Decoction and CB

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。此網(wǎng)絡(luò)共包含44 個(gè)節(jié)點(diǎn)，147 條邊，Degree 值大于10 的蛋白靶點(diǎn)有10 個(gè)，它們分別是：TNF（degree 值為20）、CXCL8（20）、IL1B（19）、IL6（17）、CCL2（16）、MMP9（16）、ALB（13）、VEGFA（13）、TLR4（11）、MMP1（11）。說明這些靶點(diǎn)在治療CB 中存在重要作用。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及靶點(diǎn)degree 值可視化Fig.2 PPI network diagram and visualization of target degree values

2.4 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析 GO 富集分析總共富集到66 條BP，11 項(xiàng)MF 相關(guān)，16 項(xiàng)CC 相關(guān)。利用生物信息學(xué)平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化分析，選取靶點(diǎn)Count 值≥7 的富集結(jié)果進(jìn)行展示，如圖3。結(jié)果顯示，桑麻止咳湯治療CB 在生物過程中，主要包括RNA 聚合酶Il 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)；細(xì)胞組成主要包括細(xì)胞外間隙，質(zhì)膜，細(xì)胞表面等；分子功能包括同一蛋白質(zhì)結(jié)合，內(nèi)肽酶活性等。

圖3 GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

KEGG 總共富集到49 條信號(hào)通路。利用生物信息學(xué)平臺(tái)進(jìn)行可視化分析，選取靶點(diǎn)Count 值排名靠前的20 條通路進(jìn)行展示。見圖4。主要包括IL-17信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用信號(hào)通路和AGE-RAGE 信號(hào)通路等。

圖4 KEGG 富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

2.5 中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果見圖5，degree 值排名靠前的成分有quercetin（槲皮素degree 值為505）、palmitic acid（棕櫚酸：484）、kaempferol（山奈酚：404）、myristic acid（肉豆蔻酸：257）、methyl palmitate（棕櫚酸甲酯：252）、apigenin（芹菜素：202）；degree值排名靠前的靶點(diǎn)有CA1（degree 值為181）、CA2（178）、CYP19A1（164）、ESR2（136）、CA4（135）、CA12（134）、ACHE（131）、CA9（121）、CA7（114）、AR（113）、ESR1（109）、EGFR（106）、ALOX5（105）、PTGS2（103）、MAOA（101）。

圖5 中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Traditional Chinese medicine-component-disease target network diagram

2.6 分子對接結(jié)果 將6 種核心潛在化合物與10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，最終得到60 組受體-配體對接結(jié)果。在60 組受體-配體結(jié)果中，其中Affinity＜-6 kcal/mol 的組合共有32 組，超過50%。其中對接得分最高的為：MMP9-芹菜素（apigenin），對接得分最低的為CXCL8-棕櫚酸（palmitic acid）和CXCL8-棕櫚酸甲酯（methyl palmitate），分值為-3．9 kcal/mol，這表明所篩選的潛在核心化合物與核心靶點(diǎn)之間可能具有較好的結(jié)合活性。對接結(jié)果可為今后進(jìn)一步開展相關(guān)中藥及成分的實(shí)驗(yàn)篩選提供數(shù)據(jù)支撐，分子對接結(jié)果見圖6。部分核心化合物對接結(jié)果示意圖見圖7。

圖6 分子對接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results

圖7 桑麻止咳湯部分核心化合物對接結(jié)果示意圖Fig.7 Schematic diagram of the docking results of some core compounds in Sangma Zhike Decoction

3 討論

燥邪為西北燥證的主要致病因素為風(fēng)、寒、熱邪，飲食習(xí)慣與居住環(huán)境也屬于其致病因素。燥邪從皮毛、口鼻而入，先傷氣津，后傷陰血，傳變至臟腑，于是形成由表及里、由氣及血、由陽入陰的諸多臟腑交互影響的病證狀態(tài)[6]。劉浩[7]研究表明，西北燥證與慢性支氣管炎之間存在聯(lián)系，西北燥證人群比非西北燥證人群患慢性支氣管炎的幾率高出5．523 8 倍。西北燥證已經(jīng)是導(dǎo)致慢性支氣管炎發(fā)病的重要因素。

慢性支氣管炎中醫(yī)稱為咳嗽，慢性咳嗽的發(fā)病率為3%～5%，老年人發(fā)病率為10%～15%[8]。慢性支氣管炎多為虛實(shí)夾雜，病機(jī)與飲、痰、虛密切相關(guān)。對于慢性支氣管炎急性發(fā)作期患者，多見于外邪犯肺，或痰濕郁肺，或痰熱蘊(yùn)肺，王成祥教授強(qiáng)調(diào)“急則治其標(biāo)”，重在清肺化痰，祛邪利肺[9]。肺體，肺之形體，位于胸中隔上，覆蓋心與心包者也。其病則司氣失職，宣肅不利，邪客本體。于是呼吸有礙，氣失宣肅，其以宣發(fā)不及為主者，見咳嗽、氣急、氣短等癥；氣郁痰結(jié)，則咳痰、胸悶、脅痛生焉。論其治也，當(dāng)取清宣肺體之法，自擬桑麻止咳湯。桑麻止咳湯強(qiáng)于清化肺熱、去除痰熱，疏調(diào)全身氣機(jī)。肺主一身之氣，肺氣清肅，才能使得全身氣血運(yùn)行順暢。

該研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對桑麻止咳湯進(jìn)行分析，核心成分有槲皮素、棕櫚酸、山奈酚和芹菜素等。其中槲皮素具有抗炎、抗病毒活性和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[10]。槲皮素可以抑制鼻病毒在氣道上皮細(xì)胞的復(fù)制，還可以降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)并改善鼻病毒感染小鼠的肺功能[11]。山奈酚在抑制炎癥細(xì)胞功能以及抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)方面的有較好效果[12]。芹菜素具有多種生物學(xué)功能，如抗炎，抗氧化、抗菌、抗病毒等[13]。

桑麻止咳湯的作用核心靶點(diǎn)主要為TNF、MMP9 和ALB 等。TNF-α 是一種促炎因子，在患有慢性阻塞性肺病的大鼠肺組織中表達(dá)上調(diào)，還可能使氣道上皮結(jié)構(gòu)失去完整性[14]。MMP9 在慢性阻塞性肺病急性發(fā)作期水平明顯升高，肺組織內(nèi)的炎癥細(xì)胞數(shù)增多，由此推斷，MMP9 水平失衡可能是COPD 急性發(fā)作的重要原因[15]。ALB 是一種有肝臟合成的中等大小的蛋白分子，也是人體血漿中重要的蛋白質(zhì)，在炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激中起重要作用[16]。

桑麻止咳湯治療西北燥證兼慢性支氣管炎的作用通路可分為兩類：1）炎癥反應(yīng)通路，如IL-17 信號(hào)通路，IL-17 可以通過刺激中性粒細(xì)胞，從而釋放彈性蛋白酶，對肺組織產(chǎn)生損害，參與了慢性肺部疾病發(fā)病。同時(shí)IL-17 可通過誘導(dǎo)炎癥和趨化因子釋放，加重氣道和肺部炎癥，還可通過影響?zhàn)ひ旱鞍谆虮磉_(dá)致使黏液分泌，從而加重氣道炎癥[17]。王燕等[18]發(fā)現(xiàn)，西北燥證患者存在免疫狀態(tài)紊亂，其血清IL-17A 水平明顯升高，IL-17A 募集炎癥細(xì)胞，促進(jìn)前炎癥因子生成。2）免疫相關(guān)通路：如AGERAGE 信號(hào)通路，抗RAGE 抗體，RAGE 的特異性抑制劑以及一些可以干擾或抑制RAGE 表達(dá)和相關(guān)信號(hào)通路的化合物，可以用于治療慢性支氣管炎，防止遷延不愈，引發(fā)慢性阻塞性肺疾病[19]。

綜上所述，該研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對桑麻止咳湯治療西北燥證兼CB 的作用機(jī)制進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明桑麻止咳湯是通過多成分-多靶點(diǎn)-多途徑發(fā)揮治療西北燥證兼CB 的作用，為下一步研究提供了方向。