基于網絡藥理學-分子對接探討益氣養陰通絡方抗類風濕關節炎的作用機制*

張博綸，鞠寶兆，張咪，高明利，姜泉，于靜，沈空，趙夜雨，齊慶，關蕊

（1.遼寧中醫藥大學，沈陽 110032；2.青島市第六人民醫院，青島 266000；3.遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032；4.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100000；5.北部戰區總醫院第二派駐門診，沈陽 110015）

類風濕關節炎（RA）是一種以全身對稱表現侵蝕特征的嚴重自身免疫性疾病，是破壞關節的系統性關節炎中最普遍的原因，被稱為“不死的癌癥”[1]。治療上目前無根治方法，以改善、減緩為主。中醫根據癥狀相關，認為RA 癥狀體征屬“痹證”“尪痹”范疇，虛則肝腎、氣陰、氣血虛損，實則風濕、寒濕、濕熱作祟，痰瘀阻滯，傳統醫學經辨證論治、四診合參，治療上虛予益氣、滋陰、養肝、補腎，實予寒者熱之、熱者寒之、濕者燥之、滯者通之[2]。而痹證日久，必然出現以關節虛痛、腫大為主，伴肌肉酸痛，乏力氣短，口眼干澀為主要表現的氣陰兩虛證。氣陰兩虛，則臟腑肢節均未得濡潤滋養而發為虛痛。故治療上以益氣滋陰，榮絡止痹為主，方隨法立，提出益氣養陰通絡方以榮血脈肢絡之損，止臟腑肢節之痛。益氣養陰通絡方源于古方“四神煎”，四神煎用治于RA 為筆者所在課題組于2017 年《類風濕關節炎病證結合診療指南》中首次明確，該方由生黃芪、石斛、遠志、牛膝、金銀花協成，具體組方配伍意義在討論中詳述，總而言之，該方發揮益氣滋陰，榮絡止痹之功，用于治療關節腫大為主證的痹證，同時伴隨肌肉酸痛、氣短乏力、口干眼澀、自汗、盜汗等氣陰兩虛證。

益氣養陰通絡方治療RA 的臨床療效與安全性在課題組的前期臨床試驗中已經明確，試驗表明該方在改善關節炎癥狀體征、降低炎性因子滴度、降低中醫證候評分及安全性方面有顯著優勢[3]，但是由于四神煎治療RA 的明確提出距今僅6 年，且復方藥物組成復雜，因此該方干預RA 療效產生機制的詳細研究明顯不足，支撐其治療功效的生物活性化合物仍不清楚，限制了該方的深入挖掘與發展。而通過網絡藥理學與分子對接，能夠初步明確復方干預RA 的主要成分、可能作用靶點及信號通路，至此，筆者所在課題組將進一步對預測通路進行體內外實驗驗證，以實現復方干預RA 機制的清晰化，為臨床研究與應用提供指導意義。

1 材料與方法

1.1 益氣養陰通絡方成分篩選及靶點預測 在中醫藥系統藥理學平臺（TCMSP，http：//tcmsp-e.com/），以益氣養陰通絡方組方中“黃芪”“牛膝”“金銀花”為關鍵詞，篩選出口服生物利用度（OB）≥30、類藥性（DL）≥0.18 的有效成分。益氣養陰通絡方組方中“石斛”“遠志”無法在TCMSP 中檢索，因此在本草組鑒（HERB，https：//herb.co）中以中藥名稱為關鍵詞檢索，獲得“related ingredients”后，通過Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲得藥物成分化學式（Canonical SMILES ID）。此外，查閱近5 年相關中藥文獻補充各中藥化學成分信息。將TCMSP、HERB-Pubchem 及文獻補充獲取的成分信息通過Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行潛在作用靶點的預測，靶點篩選結束后，借助UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）實現蛋白靶點名稱的格式一致性處理。

1.2 類風濕關節炎相關靶點篩選 選取關鍵詞“rheumatoid arthritis”“rheumatoid”在Genecards 數據庫（https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//omim.org/）和DRUGBANK（https：//go.drugbank.com）中篩選疾病關鍵靶點，其中DRUGBANK 主要用于RA 臨床一線西藥的靶點挖掘，如甲氨蝶呤，反向補充RA 疾病靶點數據庫。經過反向補充后，進行合并后去重，獲得最終的RA靶點。

1.3 構建“益氣養陰通絡方-成分-靶點”網絡和蛋白相互作用（PPI）網絡 將益氣養陰通絡方組方單味藥名稱“黃芪”“石斛”“遠志”“牛膝”“金銀花”及各單味藥潛在靶點-活性成分輸入Cytoscape 3.8.0軟件，通過計算對益氣養陰通絡方進行拆解，構建“藥物-成分-靶點”網絡圖以實現益氣養陰通絡方成分靶點的可視化。將益氣養陰通絡方成分和RA靶點上傳到韋恩圖繪制平臺[Venny 2.1.0（csic.es）]，繪制出體現益氣養陰通絡方與RA 可能靶點交集的VENN 圖，預測出復方干預RA 的治療靶點情況。將靶點蛋白交集數據上傳String 11.0 數據庫（https：//string-db.org/），經過計算獲得益氣養陰通絡方抗RA 在蛋白質層面的可視化蛋白相互作用圖，隨后通過Cytoscape 3.8.0 數據庫的Bisogenet 插件計算度值，通過調節交集靶點的度值（Degree 值），使Degree 大于60，得出交集蛋白的核心基因。

1.4 復方成分-RA 靶點-通路的富集分析 整理交集靶點數據，按照要求錄入Metascape 平臺（https：//metascape.org），設置P＜0.01 為選擇意義，進行經典的基因本體（GO）功能獲得重要交集靶點的細胞組分（CC）、生物過程（BP）及分子功能（MF），進行KEGG 通路富集分析（https：//www.kegg.jp/）獲得益氣養陰通絡方干預RA 可能的關鍵作用通路。對GO 和KEGG 結果分別選取前10 個和25 個條目，通過Bioinformatics（https：//www.bioinformatics.org）將數據轉化為可視化圖片。

1.5 構建復方成分-RA 靶點-通路網絡圖 將復方活性成分、潛在治療靶點及KEGG 富集前25 條通路導入Cytoscape 3.8.0 軟件構建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡，利用CytoNCA 插件計算網絡中度值、中心介度、緊密度等拓撲學參數，根據度值設置圖形大小，度值越高，圖形越大，地位越重要。將益氣養陰通絡方成分、靶點與疾病靶點之間，以信號通路相連接，獲得益氣養陰通絡方作用于RA 后，發揮治療作用的靶點蛋白與通路。

1.6 分子對接驗證 該研究擬驗證4 個核心靶點，首先是SRC 和STAT3，兩者在核心靶點中度值最高，可能最關鍵，所以選擇兩者進行分子對接驗證。另外，PIK3R1、AKT1 的選擇是考慮到研究后續擬開展PI3K/AKT 信號通路介導細胞自噬的驗證，PI3K作為PI3K/AKT 信號通路的上游，是該通路的始動點，PIK3R1 是PI3K 的P85 亞基，對PI3K 功能有重要作用，故選其進行對接驗證，AKT 是PI3K/AKT 信號通路的關鍵蛋白，自噬主要由AKT 家族中的AKT1 介導，同時網絡藥理學結果預測的靶點為AKT1，故選擇AKT1 與關鍵成分進行對接。綜上，該研究選取這4 個關鍵靶點與關鍵成分進行分子對接驗證。

首先從RSCB 蛋白質結構數據庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）中下載SRC（PDB ID：1a07）、STAT3（PDB ID：6njs）、PIK3R1（PDB ID：1pbw）、AKT1（PDB ID：6hhj）的晶體復合物用于分子對接研究，獲得3D結構后，以PDB 格式導出。然后進行蛋白受體選擇，首先根據小分子的結構特點，首選結構類似的小分子與蛋白的晶體復合物結構進行對接，再進一步根據分辨率選擇結構更加準確的蛋白晶體作為受體，篩選分辨率時，根據? 值，? 值越小，分辨率越高，結構越準確。經PyMOL 2.4.1 軟件，Auto Dock 4.2.6軟件完成蛋白靶點去水和去配體、靶蛋白加氫和計算電荷，最終獲得活性成分和靶點的結合分數，以結合能大小初步評價對接效果。然后通過Auto Dock Vina 1.1.2 軟件進行對接[4]，將對接結果錄入PyMOL 2.4.1 進行數據可視化，獲得分子對接作用模式圖。

2 結果

2.1 益氣養陰通絡方活性成分及有效作用靶點 通過TCMSP（OB≥30%，DL≥0.18）、HERB 并結合文獻，篩選后共收集到益氣養陰通絡方組方中5 味中藥（黃芪、石斛、遠志、牛膝、金銀花）的83 種活性成分，大于10 類化學成分者取前10 類，不足者全部列出，黃芪、牛膝、金銀花、石斛、遠志的活性成分數分別為20、20、23、13、7 種，其中山奈酚和槲皮素為黃芪、牛膝和金銀花共有，豆甾醇和β-谷甾醇為牛膝和金銀花共有（表1）。通過Swiss Target 數據庫預測有效成分靶點，共預測出779 個潛在靶點。

表1 益氣養陰通絡方藥物成分相關信息Tab.1 Information about the ingredients of Yiqi Yangyin Tongluo Recipe

2.2 RA 相關靶點獲取與“藥物-成分-靶點”網絡構建 RA 相關靶點在Genecards、OMIM 數據庫中分別獲得5 017、525 個，剔除重復值后，實際獲得5 393 個靶點，與益氣養陰通絡方的779 個潛在靶點取交集，獲得465 個交集靶點，提示益氣養陰通絡方可能通過這些靶點改善RA，繪制VENN 圖，見圖1。利用Cytoscape 3.8.0 軟件繪制益氣養陰通絡方治療RA 的“藥物-成分-靶點”網絡圖（圖2），圖中綠色圓形代表藥物成分，V 形代表藥物成分，其中下方獨立的4 個成分為多味中藥共有，中間淺藍色橢圓形代表潛在靶點，從圖中可以看出益氣養陰通絡方、成分、靶點之間彼此連接又相互作用，體現了益氣養陰通絡方多成分、多靶點協同作用的特征。

圖1 益氣養陰通絡方靶點與RA 互作靶點VENN 圖Fig.1 VENN diagram of crossing target of Yiqi Yangyin Tongluo Recipe and rheumatoid arthritis

圖2 “益氣養陰通絡方藥物-成分-靶點”調控網絡圖Fig.2 “Yiqi Yangyin Tongluo Recipe drugs-ingredient-targets” network

2.3 PPI 網絡構建及拓撲 益氣養陰通絡方與RA交集后所得465 個靶點信息上傳至String 11.0 數據庫，獲得相關網絡信息并利用Cytoscape 3.8.0 重新構建靶蛋白PPI 網絡（圖3）。得到PPI 網絡后，運用Cytoscape 3.8.0 中的Bisogenet 插件計算度值，篩選出度值大于60 的核心靶點基因，分別為SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3R1、GRB2、AKT1、PIK3CA（圖4），通過Cytoscape 3.8.0 插件Cyto NCA計算9 個核心基因相關信息（表2），其中SRC 度值83，是益氣養陰通絡方治療RA 最可能的作用靶點，此外，STAT3、MAPK3、MAPK1、PIK3R1、AKT1、PIK3CA等度值也較高，提示相關靶點可能是益氣養陰通絡方治療RA 發揮作用。

圖3 PPI 蛋白互作網絡圖Fig.3 Protein-protein interaction network

圖4 核心靶點PPI 圖Fig.4 Protein-protein interaction network of core targets

表2 核心基因相關信息Tab.2 Related information of core genes

2.4 益氣養陰通絡方成分-RA 靶點-通路的富集分析 GO 功能分析結果顯示，BP 有明顯的關鍵富集進程，即肽基酪氨酸自體磷酸化，CC 關鍵富集于質膜細胞質側的外部成分，MF 關鍵富集于非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性和細胞表面受體蛋白酪氨酸激酶活性（圖5A）。圖5B 為KEGG 富集分析結果，圖中氣泡越大，關聯基因數越多，顏色越紅，P 值越小。圖5B 中展示了益氣養陰通絡方干預RA 排名前25的信號通路（P＜0.05），主要生物學過程包括癌癥相關、PI3K-AKT、癌癥相關蛋白聚糖、神經活性配體-受體相互作用、HF-1、ErbB 及VEGF 信號通路等，提示益氣養陰通絡方可能通過這些信號途徑改善RA。根據KEGG 和GO 富集結果，在P＜0.05 范圍內，參考count 值，并結合PPI 結果，推測PI3K-AKT信號通路可能是益氣養陰通絡方治療RA 的重要通路之一。同時，結合查閱文獻，發現其在膠原誘導性關節炎大鼠中存在表達異常，因此選其進行后續分子對接與驗證[3]。

圖5 益氣養陰通絡方成分-RA 靶點-通路富集分析Fig.5 Yiqi Yangyin Tongluo Recipe components-RA target-pathway enrichment analysis

2.5 構建益氣養陰通絡方“成分-RA 靶點-通路”網絡圖 Cytoscape 3.8.0 構建益氣養陰通絡方“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡圖（圖6），網絡圖中，共有856 個節點，5 116 條邊，包括1 種疾病，前25 條信號通路，5 味藥物及其73 個活性成分和752 個靶點。圖中度值越高，節點形狀越大，說明該節點越關鍵，在活性成分中，槲皮素、山奈酚、川芎哚度值較高；在潛在治療靶點中，CYP19A1、ESR1、ESR2 等度值較高；在信號通路中，度值排名前3 為癌癥通路、PI3K-AKT 信號通路、癌癥中的蛋白多糖信號通路，以上結果提示上述成分、靶點及通路可能是復方改善RA 的關鍵組分。

圖6 益氣養陰通絡方成分-RA 靶點-通路網絡圖Fig.6 Yiqi Yangyin Tongluo Recipe composition-RA target-pathway network diagram

2.6 分子對接驗證結果 根據PPI 及KEGG 分析結果，研究選定益氣養陰通絡方的11 種主要活性成分與關鍵靶點SRC、STAT3、PIK3R1、AKT1 進行對接，結果見圖7，圖中數值代表Affinity 的絕對值，Affinity 的絕對值越大，顏色越深，說明蛋白與活性成分的結合越牢固，越有可能相互作用，圖中Affinity ≤-5.0 kJ/mol 者占總數 93.18%，其中Affinity≤-7.0 kJ/mol 者占總數47.72%，結果表明益氣養陰通絡方大部分成分與關鍵靶點的結合活性較佳，其中與AKT 的結合可能最大，提示益氣養陰通絡方藥物可能通過作用于這些關鍵靶點而發揮作用。

圖7 分子對接結果熱圖Fig.7 Heat map of molecular docking results

挑選結合能最低的靶蛋白-化合物的最優構象進行可視化，通過對接構象展現兩者之間的相互作用（圖8）。圖8 中，SRC 與shihunin 對接可視化中，shihunin 可能借助氫鍵與SRC 的THR-182[5]和THR-183[6]氨基酸殘基相互作用；STAT3 與Inophyllum-E對接可視化中，Inophyllum-E 可能借助氫鍵與STAT3 的ASP-369 和LEU-438[7]氨基酸殘基相互作用；PIK3R1 與Inophyllum-E 對接可視化中，Inophyllum-E 可能借助氫鍵與PIK3R1 的HIS-234[8]、ARG-228[9]和TRP-237[10]氨基酸殘基相互作用；AKT1與Chryseriol 的對接可視化中，Chryseriol 可能借助氫鍵與AKT1 的ASN-199、ASN-53[11]和SER-216[12]氨基酸殘基相互作用。

圖8 分子對接可視化結果Fig.8 Visualization results of molecular docking

3 討論

RA 病變表現為常累及滑膜、腕和足等多關節炎癥，同時伴結節的形成[13-14]，同時又與許多炎癥性疾病相似，具有靜止（緩解期）和加重發作（活動期）的特征[15]。RA 是由患者自身遺傳因素和環境因素間相互交織，引致自身免疫功能失調的疾病[16]。目前，西醫學較認可的治療方案較經典，包括傳統抗風濕藥、小劑量糖皮質激素、生物制劑等，然而，這些常規治療的效果不盡如人意，甚至只產生部分有效反應，關節癥狀持續緩解實現不良，需要持續的藥物治療[17]。但是藥物的長期干預，必然會出現相應的毒副作用，不僅侵害患者的身體、心理，甚至會加重患者的經濟負擔、降低生活質量。中藥制劑的干預在醫學界受到普遍的認同，具有增強療效、減弱不良反應及改善血清學指標的作用，因此，中西醫聯合療法的預期前景非常好。課題組前期研究已明確該方干預RA 的臨床療效與安全性，但是目前缺少關于干預機制的研究，干預機制的明確將會為該方的臨床應用提供實驗基礎。

益氣養陰通絡方基于古方“四神煎”而立[18]。四神煎為2017 年《類風濕關節炎病證結合診療指南》中首次明確，其用治于RA 的相關基礎研究尚且不足，研究通過網絡藥理學的方法對其干預RA 的作用靶點和信號通路進行挖掘和預測，便于之后開展相關基礎研究。方中生黃芪重用，不僅專補氣，“善達皮腠，專通肌表”，又“逐五臟間惡血”（《本草經集注》），現代研究證實本品確有活血之效[19]，故作“療皮水風濕之疾，歷節腫痛最效”。石斛，強陰益精，生津養胃，補內絕不足。遠志，益精補陰氣，“長肌肉，助筋骨”，又散郁豁痰，使濕毒孤立，絡通痛止。川牛膝，善活血止痹，益肝腎，強筋骨，又可引藥達所，錨定而效，通絡除下肢痹痛。與生黃芪同用，走而能補，引而通痹。金銀花，清補兼顧，常以清解絡毒，然銀花“補之性實多于攻”“少用則補多于攻”“且能補氣，更善補陰”（《本草新編》），因此方中銀花以15 g入方，以補虛為主，尤補陰虛，又可入絡清解虛實之毒。痹為久疾、頑疾，不能遽通，當培本行滯，榮絡止痹為主，輔以活血通絡，因此方中以益氣養陰為主，寓通于補、榮脈通痹，陽生陰長。諸藥相伍，本虛得資，標實得清，補而不滯，通而不遽，正邪兼顧，共奏益氣滋陰，榮絡止痹之功。現代研究表明，調控炎癥反應是防止RA 關節病理進展的重要干預手段[20-21]。研究表明，黃芪核心成分黃芪多糖、黃芪甲苷均能夠減輕炎癥反應，黃芪總皂苷促進滑膜成纖維細胞凋亡，抑制炎癥反應[22]；霍山石斛莖的重要成分多糖參與免疫調節，且可以通過干預炎性進展，緩解關節滑膜炎性病變[23]；遠志皂苷能夠減輕細胞氧化損傷，降低細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平[24]；川牛膝中所含有的甾體具有體外抗炎作用[25]；金銀花醇提物的抗炎作用非常明確，研究表明抗炎機制與減少MDA、NO 含量及SOD 活性有關[26-27]。益氣養陰通絡方不僅組方配伍上定而施效，現代藥理學亦能有效支持各單味藥的有效性。

研究通過網絡藥理學與分子對接技術對益氣養陰通絡方干預RA 的可能作用靶點和信號通路進行預測與驗證，從分子層面為益氣養陰通絡方發揮療效進行基礎的完善與延伸。通過網絡藥理學共篩選出益氣養陰通絡方的83 種活性成分和779 個潛在靶點，RA 相關靶點5 393 個，益氣養陰通絡方成分與RA 疾病交集靶點465 個，其中交集核心靶點9 個，分別為SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3R1、GRB2、AKT1、PIK3CA。SRC 家族激酶影響多種細胞信號通路，這些通路調節細胞的運動、生存、增殖、黏附和侵襲。研究證明，在實驗性關節炎模型中，SRC 激酶敲除小鼠由于炎性細胞產生細胞因子和趨化因子功能存在缺陷，因此可免受炎癥細胞浸潤炎癥關節。在RA 患者中，滑膜細胞和滑膜巨噬細胞存在過表達的SRC。SRC 激酶在體內和體外均具有抗關節炎的潛力[28]。研究表明，B 細胞中STAT3去甲基化修飾參與調控類風濕關節炎[29]。另一項研究證實STAT3 是RA 滑膜細胞存活所必需的調節因子并且STAT3 抑制劑已被提議作為RA 治療的候選藥物[30]。MAPK1、MAPK3 是MAP 激酶家族的成員，均參與級聯反應，并發揮重要作用，該級聯通過響應各種細胞外信號來調節多種細胞過程，如增殖、分化和細胞周期[31]。MAPK 信號轉導通路調控炎性細胞因子和細胞轉導通路，從而影響關節炎癥和破壞[32]。研究表明，MAPK1 調節Bcl-2 表達并激活caspase 級聯反應[33]。MAPK3 促進RUNX2 的表達和定位MAPK3 影響成骨細胞分化[34]。HSP90AA1 在改善軟骨代謝[32]，參與DNA 損傷調節、細胞周期調節、基因表達和致癌作用中發揮重要作用[35]。另一項研表明，HSP90AA1 作為分子伴侶，輔助細胞內分子組裝和蛋白質折疊，參與成纖維細胞活化的多個過程[36]。GRB2 是一種支架蛋白，GRB2 與FAK 的結合，并導致細胞外信號調節激酶1/2（ERK）的激活[37]。GRB2 通過GRB1-PI3K-AKT 通路促進心臟肥大[38]，對心臟纖維化調節至關重要。PI3K 是一種異質二聚體，由PIK3R1 和PIK3CA 基因構成，兩者分別編碼PI3K 催化亞基p110α 和調節亞基p85α，此外還由其他編碼PI3K 相關調節因子的基因組成。PI3K通路活性，受到多因素的調控，其中PIK3CA 和PIK3R1 功能性突變產生的互斥關系是調控通路激活或抑制的重要環節[39]。綜上所述，益氣養陰通絡方與RA 的9 個核心交集靶點均從不同角度、不同途徑影響炎性進程或RA。

GO 功能分析與KEGG 富集分析表明，益氣養陰通絡方干預RA 的可能作用通路包括PI3KAKT、癌癥相關及神經活性配體-受體相互作用等多條通路，其中PI3K-AKT 信號通路是益氣養陰通絡方干預RA 可能性最大的通路之一。分子對接中，益氣養陰通絡方的11 種主要活性成分與關鍵靶點SRC、STAT3、PIK3R1、AKT1 均有較穩定的結合，其中與AKT 的結合可能最大。AKT 是PI3K-AKT 信號通路的重要下游蛋白，因此初步驗證了PI3KAKT 信號通路可能是益氣養陰通絡方干預RA 的關鍵通路之一。PI3K-AKT 信號通路是一種細胞內信號通路，參與細胞凋亡、血管生成、自噬等進程[40]。蛋白激酶B（AKT）在I3K/AKT 信號通路中扮演信號轉導樞紐的角色，AKT 的活化靶向調控下游因子，如mTOR 蛋白復合體、Bcl-2 家族蛋白Bax、Bcl-2凋亡相關的啟動子等多種蛋白，引起連鎖反應發揮細胞穩態調節功能[41]。

綜上所述，基于網絡藥理學與分子對接，以益氣養陰通絡方為研究對象，以RA 為干預目標，通過網絡藥理學與分子對接初步預測并驗證了益氣養陰通絡方干預RA 的作用靶點與信號通路。筆者通過網絡藥理學預測所得藥物干預疾病的可能作用通路，為益氣養陰通絡方的臨床有效使用提供一定的證據支持。