貝達(dá)喹啉聯(lián)合吡嗪酰胺對耐多藥肺結(jié)核患者的影響*

周靜 曾忠 賴海斌

耐多藥肺結(jié)核是通過呼吸道傳播的結(jié)核病，屬于耐藥結(jié)核病的一種，是臨床的常見病、多發(fā)病，是目前引起死亡的主要傳染病[1]。它屬于難治性肺結(jié)核，主要是指結(jié)核分枝桿菌感染患者對常用抗結(jié)核藥物異煙肼和利福平的耐藥性。在現(xiàn)今研究階段中，我國結(jié)核病及耐多藥肺結(jié)核發(fā)病情況較為惡劣，總發(fā)病人數(shù)已經(jīng)達(dá)到了全球總患者的1/4，成為世界第22 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家。耐多藥肺結(jié)核治療有效率較低，復(fù)發(fā)率、死亡率較高，且治療費(fèi)用高[2-3]。結(jié)核病的發(fā)生對人們生命健康造成了極大的威脅，且由于治療不當(dāng)或經(jīng)濟(jì)困難，耐藥結(jié)核病患者數(shù)量逐年增加[4]。目前，結(jié)核病的治療多采用抗結(jié)核藥物，然而，耐多藥肺結(jié)核的高傳染性和高空洞形成率，傳統(tǒng)藥物難以有效控制病情，實(shí)現(xiàn)有效治療[5]。本文旨在探究貝達(dá)喹啉聯(lián)合吡嗪酰胺對耐多藥肺結(jié)核患者微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）、微小RNA-223（microRNA-223，miR-223）表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年4 月—2021 年4 月贛州市第五人民醫(yī)院收治的耐多藥肺結(jié)核患者232 例，按照隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為吡嗪酰胺組和聯(lián)合治療組，各116 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合文獻(xiàn)[6]《肺結(jié)核基層診療指南（2018 年）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有心肝腎等機(jī)體重要臟器嚴(yán)重受損；對本次研究藥物過敏；有肺炎、肺癌等疾??；合并肺外結(jié)核；有嚴(yán)重的精神疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者、家屬均知情同意。

1.2 方法

吡嗪酰胺組根據(jù)患者藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇吡嗪酰胺（生產(chǎn)廠家：沈陽紅旗制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H21022354，規(guī)格：0.25 g）口服治療，每次0.75 g，2 次/d，連續(xù)24 周。聯(lián)合治療組在吡嗪酰胺組的基礎(chǔ)上采用貝達(dá)喹啉 片（生 產(chǎn) 廠 家：Recipharm Pharmaservices Private Limited，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字HJ20171366，規(guī)格：100 mg）治療，前2 周劑量為400 mg，1 次/d，2 周后更改劑量為200 mg，3 次/周，連續(xù)使用24 周。

1.3 觀察指標(biāo)與評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 miR-155、miR-223 表達(dá)量檢測 采用RT-PCR法檢測miR-155、miR-223 表達(dá)量，取兩組外周靜脈血3 mL，分離出單個(gè)核細(xì)胞，提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA采用Trizol 法，檢測RNA 含量、純度，使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后得到cDNA，設(shè)計(jì)引物序列采用Primer5.0 軟件，以U6 為內(nèi)參，U6 引物上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，引物下游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，miR-155 引 物上 游：5'-GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'，引物下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，miR-223 引物上游：5'-GGGGGTGTCAGTGTCAAAT-3'，引物下游：5'-CAGTGCAGGGTCCCGAGGTAT-3'。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 次循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，拍照分析光密度值，計(jì)算miR-155、miR-223 相對表達(dá)量。

1.3.2 腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）、C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（aspartic transaminase，AST）、總蛋白（total protein，TP）水平檢測 采用酶聯(lián)免疫 吸 附 試 驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，抽取所有患者治療前1 d 及治療后1 d 清晨空腹靜脈血3 mL，分離血清，-80 ℃保存。使用稀釋液對血清進(jìn)行稀釋。其次，在反應(yīng)孔內(nèi)將稀釋好的55 μL 標(biāo)準(zhǔn)品加入其試管內(nèi)，隨后將其置于室內(nèi)常溫環(huán)境中進(jìn)行30 min 的孵育。再次，采用相關(guān)洗滌液洗滌，洗滌次數(shù)為3 次，待洗滌3 次結(jié)束后，將相關(guān)抗體工作液（55 μL）加入，加入后放置于常溫中進(jìn)行10 min 孵育。最后，洗滌3 次，加入115 μL 終止液終止反應(yīng)，450 nm 波長測量每孔 吸 光 度，查 出ADA、CRP、IL-6、IL-2、ALP、ALT、AST、TP 水平。

1.3.3 第1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 s，F(xiàn)EV1）、FEV1/用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）%、每分鐘最大通氣量（maximum ventilation volume，MVV）水平檢測 兩組患者治療前1 d 及治療后1 d 采用德國耶格公司Masterscreen Pneumo肺功能儀檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 臨床療效 顯效：臨床癥狀基本消失，經(jīng)X 線檢查結(jié)果顯示病灶吸收，空洞閉合；有效：臨床癥狀有所改善，經(jīng)X 線檢查結(jié)果顯示病灶無明顯變化；無效：未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。顯效+有效=總有效。

1.3.5 不良反應(yīng) 對兩組患者治療過程中肝損傷、惡心嘔吐、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、腹瀉腹脹等不良反應(yīng)發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

吡嗪酰胺組：男68 例，女48 例，年齡31～49 歲，平均（38.00±6.55）歲，病程1～3 年，平均（1.90±0.95）年；聯(lián)合治療組：男72 例，女44 例，年齡31～48 歲，平均（38.18±6.92）歲，病程1～3 年，平均（1.91±0.88）年。兩組患者上述性別、年齡、病程比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組miR-155、miR-223 表達(dá)量比較

兩組治療前miR-155、miR-223 表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后miR-155、miR-223 表達(dá)量均明顯降低，且與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組miR-155、miR-223 表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組miR-155、miR-223表達(dá)量比較（±s）

*與本組治療前相比，P＜0.05。

組別 miR-223 miR-155治療前 治療后 治療前 治療后吡嗪酰胺組（n=116）16.24±5.14 14.55±4.15* 823.26±152.36 662.36±142.58*聯(lián)合治療組（n=116）16.22±5.12 4.21±1.36* 823.24±152.34 415.59±126.54*t 值 0.030 25.500 0.001 13.940 P 值 0.976 0.001 0.999 0.001

2.3 兩組ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平比較

兩組治療前1 d ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后1 d ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平均明顯降低，且與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組ADA、CRP、IL-6、IL-2水平比較（±s）

表2 兩組ADA、CRP、IL-6、IL-2水平比較（±s）

*與本組治療前1 d 相比，P＜0.05。

組別 ADA（U/L）CRP（mg/L）治療前1 d 治療后1 d 治療前1 d 治療后1 d吡嗪酰胺組（n=116）39.42±12.36 31.62±10.21* 41.69±11.24 31.26±10.24*聯(lián)合治療組（n=116）39.40±12.34 22.69±6.41* 41.67±11.22 18.65±5.14*t 值 0.012 7.978 0.014 11.854 P 值 0.990 0.001 0.989 0.001組別 IL-6（ng/L）IL-2（ng/L）治療前1 d 治療后1 d 治療前1 d 治療后1 d吡嗪酰胺組（n=116）57.62±15.62 46.52±12.25* 56.36±15.24 48.52±12.69*聯(lián)合治療組（n=116）57.60±15.60 29.42±9.14* 56.34±15.22 34.52±11.24*t 值 0.010 12.050 0.010 8.895 P 值 0.992 0.001 0.992 0.001

2.4 兩組ALT、TP、ALP、AST 水平比較

兩組治療前1 d ALT、TP、ALP、AST 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后1 d ALT、ALP、AST 水平均明顯降低，TP 水平均明顯升高，且與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組ALT、ALP、AST 水平均明顯降低，TP 水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組ALT、TP、ALP、AST水平比較（±s）

表3 兩組ALT、TP、ALP、AST水平比較（±s）

*與本組治療前1 d 相比，P＜0.05。

組別 ALT（U/L）TP（g/L）治療前1 d 治療后1 d 治療前1 d 治療后1 d吡嗪酰胺組（n=116）29.35±8.42 21.62±6.41* 60.38±18.52 62.42±19.42*聯(lián)合治療組（n=116）29.34±8.41 16.24±5.14* 60.37±18.50 68.59±22.36*t 值 0.009 7.052 0.004 2.244 P 值 0.993 0.001 0.997 0.026組別 ALP（U/L）AST（U/L）治療前1 d 治療后1 d 治療前1 d 治療后1 d吡嗪酰胺組（n=116）116.35±31.25 92.36±28.51* 29.42±9.24 22.15±6.32*聯(lián)合治療組（n=116）116.33±31.24 81.36±22.26* 29.40±9.22 14.85±3.21*t 值 0.005 3.275 0.017 11.090 P 值 0.996 0.001 0.987 0.001

2.5 兩組肺功能水平比較

兩組治療前1 d 肺功能水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療后1 d 肺功能水平均明顯升高，且與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組肺功能水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組肺功能水平比較（±s）

表4 兩組肺功能水平比較（±s）

*與本組治療前1 d 相比，P＜0.05。

組別 每分鐘MVV（L）FEV1（L）FEV1/FVC%（%）治療前1 d 治療后1 d 治療前1 d 治療后1 d 治療前1 d 治療后1 d吡嗪酰胺組（n=116）50.36±16.24 55.62±18.59* 1.41±0.26 1.58±0.29* 52.52±16.41 55.48±16.95*聯(lián)合治療組（n=116）50.34±16.22 63.24±20.36* 1.40±0.24 1.82±0.36* 52.50±16.40 60.68±19.26*t 值 0.009 2.977 0.304 5.592 0.009 2.183 P 值 0.993 0.003 0.761 0.001 0.993 0.030

2.6 兩組臨床療效比較

與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組治療總有效率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.624，P=0.003），見表5。

2.7 兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較

與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組不良反應(yīng)總發(fā)生率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.338，P=0.561），見表6。

表6 兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較

3 討論

耐多藥肺結(jié)核是一種較嚴(yán)重的結(jié)核耐藥類型，臨床治愈率較低，一旦患病，對于患者健康會造成不可挽回的傷害及損傷[7]。臨床上主要采用藥敏試驗(yàn)結(jié)果對耐多藥肺結(jié)核進(jìn)行診斷[8-9]。近年來，雖然肺結(jié)核的診斷技術(shù)不斷提高，但結(jié)核病發(fā)病率仍處于高水平，控制形勢依然嚴(yán)峻[10]。目前耐多藥肺結(jié)核發(fā)病率不斷上升，因此本文研究治療耐多藥肺結(jié)核有效的藥物具有重要的意義。

貝達(dá)喹啉是一種二芳基喹啉類化合物，它通過抑制結(jié)核分枝桿菌ATP 合成酶，阻止分枝桿菌的ATP 能量供應(yīng)，達(dá)到殺菌和滅菌的效果[11]。它能特異性地與分枝桿菌的三磷酸腺苷合成酶結(jié)合并消耗ATP。具有新的抗結(jié)核機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，貝達(dá)喹啉能強(qiáng)烈抑制結(jié)核分枝桿菌分離株的耐藥、藥敏，對處于休眠狀態(tài)中的分枝桿菌也具有殺菌作用[12]。吡嗪酰胺是唯一可以在巨噬細(xì)胞半休眠狀態(tài)下殺滅結(jié)核分枝桿菌的抗結(jié)核藥物，因此，在耐多藥肺結(jié)核的治療過程中使用效果較好[13]。吡嗪酰胺是現(xiàn)代結(jié)核病短期化療的基本藥物之一。然而，隨著吡嗪酰胺的廣泛應(yīng)用，其耐藥情況也越來越嚴(yán)重[14]。本研究結(jié)果顯示，貝達(dá)喹啉及吡嗪酰胺治療耐多藥肺結(jié)核可有效提高治療總有效率，效果顯著。

microRNA（miRNA）是一類約22 nt 的非編碼單鏈RNA，可通過抑制特異性mRNA 分子，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與細(xì)胞許多生物學(xué)過程，在許多疾病的發(fā)生及發(fā)展中均具備一定的調(diào)控作用。近年來，對miRNA 表達(dá)和功能的研究顯示，miRNA水平在結(jié)核病患者機(jī)體中存在著異常于健康機(jī)體中的表達(dá)，提示其水平可能一定程度上與結(jié)核病的發(fā)生存在一定聯(lián)系，臨床可以將miRNA 作為肺結(jié)核病情的判斷標(biāo)志物，通過觀測其水平變化來掌握肺結(jié)核疾病程度。miR-223 可通過抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)核因子κB 活性，削弱機(jī)體的抗結(jié)核免疫可通過減少促炎癥因子的表達(dá)，從而抑制巨噬細(xì)胞凋亡[15]。郭存炳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，耐多藥肺結(jié)核患者使用莫西沙星可有效降低miR-155 水平從而提高化療效果。目前，miR-155 被認(rèn)為與叉頭轉(zhuǎn)錄因子3 的表達(dá)在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組miR-223、miR-155 水平均明顯降低，說明貝達(dá)喹啉及吡嗪酰胺治療耐多藥肺結(jié)核效果較優(yōu)。

ADA 是一種水解酶，在嘌呤核酸代謝中起著重要的作用。在淋巴細(xì)胞中ADA 含量最高，而在組織、細(xì)胞中含量較高，與淋巴細(xì)胞的激活和分化顯著相關(guān)[17]。CRP 是急性期反應(yīng)蛋白，能促進(jìn)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和補(bǔ)體的活化，是診斷肺結(jié)核的常用炎癥指標(biāo)[18]。IL-6 是炎癥細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，在發(fā)生內(nèi)外傷、外科手術(shù)、應(yīng)激反應(yīng)、感染、腦死亡、腫瘤產(chǎn)生及其他情況的急性炎癥反應(yīng)過程中IL-6會快速升高，同時(shí)上調(diào)其他炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，加重炎癥損傷、神經(jīng)根超敏，最終引起疼痛等相關(guān)癥狀[19]。IL-2 是一種趨化因子家族的細(xì)胞因子，來源于多細(xì)胞，具有多向作用，它在免疫應(yīng)答和抗病毒感染中發(fā)揮重要作用[20]。ALP 是一種廣泛分布在人體肝、腎、胎盤等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶[21]。ALT 存在各種細(xì)胞內(nèi)，其中在肝細(xì)胞最為廣泛，整個(gè)肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶含量大約是血液中含量的100 倍[22]。AST 主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼等組織中。相關(guān)研究顯示，耐多藥肺結(jié)核患者肺功能異常表達(dá)，肺換氣、肺通氣處于較差的狀態(tài)[23]。本研究結(jié)果顯示，與吡嗪酰胺組相比，聯(lián)合治療組ADA、CRP、IL-6、IL-2、ALT、ALP、AST 水平均明顯降低，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC%、每分鐘MVV 水平均明顯上升，這一結(jié)果說明聯(lián)合應(yīng)用貝達(dá)喹啉、吡嗪酰胺治療耐多藥肺結(jié)核患者可有效改善肺功能，降低炎癥反應(yīng)，效果顯著。

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用貝達(dá)喹啉及吡嗪酰胺治療耐多藥肺結(jié)核患者可降低miR-155、miR-223表達(dá)量，有效改善肺功能，減輕肝累及損傷，效果顯著。