NaCl脅迫下殼聚糖對菜用大豆葉、根蔗糖代謝的調控效應

李 星,孟 飛,郝佳奇,王 聰

(內蒙古民族大學 農學院,內蒙古 通遼 028042)

近年來我國農業用地鹽漬化問題尤為突出,各種類型鹽漬土總量約占全國耕地面積的20%[1],鹽脅迫已是現階段影響植物生長的主要非生物脅迫之一[2]。豆科植物可與根瘤菌共生結瘤固氮,培肥地力、增加產量并改善品質,同時,還可減少化肥氮施用量。然而,豆科植物與根瘤菌共生關系的建立會受到鹽脅迫等逆境因子的限制。李梅等[3]研究發現,隨著鹽濃度的升高,蒺藜苜蓿的根瘤數不斷減少,根瘤不斷變小,固氮區的細胞數量也相應減少。王聰等[4]研究表明,NaCl脅迫導致菜用大豆根瘤數、根瘤鮮質量、植株含氮量顯著下降,植株生長受到抑制。結瘤過程對植物本身來說是一個高度耗能的過程,需要消耗大量的碳源和能源。研究顯示,大豆根瘤每固定1 g氮,需消耗15～20 g碳水化合物,大豆光合產物的16%會被根瘤消耗[5]。而光合產物主要是以蔗糖的形式運輸到“庫”端[6],與蔗糖代謝密切相關的酶主要包括蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和轉化酶[7]。蔗糖的合成、向根部轉運及其在根部的積累狀況對豆科植物根瘤形成、生長產生重要影響。研究發現,大豆根瘤的形成和固氮作用主要依賴于蔗糖的輸入和代謝[8]。而且,蔗糖不僅為豆科植物結瘤固氮提供碳源和能源,還可作為信號分子抑制或激活結瘤相關基因表達[9]。大豆 MADS-Box 家族轉錄因子GmNMHC5能夠促進大豆結瘤,而GmNMHC5的表達受到蔗糖的調控,內源蔗糖水平提高會誘導GmNMHC5的表達進而促進大豆結瘤[10]。然而,鹽脅迫會嚴重影響植物的蔗糖代謝。NaCl脅迫可使植物葉片SPS活性下降,蔗糖轉化酶活性升高,導致蔗糖含量下降[11]。因此,增強鹽脅迫下葉片蔗糖合成及向根系的運輸能力,對促進豆科植物的結瘤固氮具有重要意義。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮玫降囊环N聚氨基葡萄糖,是一種廉價清潔的化學物質,其能夠增強植物抗逆性的觀點已得到普遍證實。研究發現,對四葉期的番茄幼苗進行殼聚糖處理,可通過提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶活性,誘導番茄幼苗產生對早疫病的抗病性[12]。干旱脅迫下,殼聚糖處理后的大豆幼苗保護酶活性增強,提高了抗旱性[13]。外源殼聚糖可通過提高辣椒幼苗體內可溶性糖含量,降低丙二醛(MDA)含量,提高辣椒幼苗抗冷性[14]。鹽脅迫下,外源殼聚糖可提高小麥種子α-淀粉酶活性,增強幼苗抗氧化能力、滲透調節能力及根系活力,誘導小麥種子及幼苗提高耐鹽性[15]。前期的研究也發現,殼聚糖可顯著提高鹽脅迫下菜用大豆的根瘤數、根瘤鮮質量和固氮量[4],但鹽脅迫下殼聚糖對豆科植物,特別是對菜用大豆結瘤調控機制的研究尚屬空白。為此,本研究探討NaCl脅迫下殼聚糖對菜用大豆蔗糖代謝及其在根部積累的影響,以期為深入研究鹽逆境下殼聚糖誘導豆科植物結瘤的生理機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

菜用大豆選用主栽品種日本青,接種與其共生匹配性較好的快生型根瘤菌HH103[16](購自黑龍江省農業科學院微生物研究所)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材培育 播種缽準備:選口徑和高度都為 10 cm且底部有小孔的塑料苗缽,引紗布條穿過(所有紗布條的長、寬規格一致),裝入蛭石,蛭石中均勻加入用無菌水配制的無氮營養液,以抓緊不滴水、松開不抱團為宜,然后將塑料缽置于口徑10 cm、裝有 1/4 Fahraeus無氮營養液的組培瓶上方,但塑料缽底部不接觸到營養液,紗布條浸入營養液用于吸取液體,以維持塑料缽中營養液濃度和 NaCl 濃度。

播種:將經過消毒的種子播入塑料缽中,每缽2粒,每缽定苗1株。

幼苗培養:幼苗在人工氣候箱中培養,白天光強為150 μmol/(m2·s),光周期為14 h光照/10 h黑暗,晝夜溫度保持在25 ℃/18 ℃。

所有試驗用具和蛭石高溫高壓滅菌20 min。

1.2.2 試驗處理 試驗設4個處理:葉面噴施無菌水,根部澆灌無氮營養液(CK);葉面噴施殼聚糖水溶液,根部澆灌無氮營養液(T1);葉面噴施無菌水,根部澆灌溶有NaCl的無氮營養液(T2);葉面噴施殼聚糖水溶液,根部澆灌溶有NaCl的無氮營養液(T3)。每處理12株,3次重復,完全隨機排列。殼聚糖處理的適宜濃度為200 mg/L,NaCl處理的適宜濃度為50 mmol/L。

1.2.3 殼聚糖誘導和NaCl處理 待2片真葉完全展開后進行殼聚糖處理。用手持小型噴霧器將殼聚糖溶液均勻噴灑在幼苗葉片上,以量足但不下滴為宜,CK和T2處理噴灑無菌水。殼聚糖誘導處理5 d后進行NaCl處理,NaCl溶于1/4濃度Fahraeus無氮營養液,均勻澆入基質中。CK和T1處理僅澆灌無氮營養液。

1.2.4 接種 NaCl處理后隨即接種。將根瘤菌懸浮液稀釋至OD600值為0.1,用移液槍取搖勻的菌懸液噴注到幼苗根部周圍,每株接種1 mL,然后再覆蓋1層1 cm左右蛭石保濕。

1.3 指標測定

蔗糖代謝指標分別在接種后0,2,5,10,20,30 d測定,根瘤數以及根瘤鮮質量在接種后10,20,30 d測定。

蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、中性轉化酶(NI)、酸性轉化酶(AI)參考趙智中等[17]的方法進行測定;蔗糖含量采用間苯二酚法測定[18],葡萄糖和果糖含量采用蒽酮-硫酸比色法測定[19]。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0與Microsoft Excel 2016軟件進行數據分析處理,多重比較采用Duncan′s新復極差法。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆結瘤的影響

由表1可知,NaCl脅迫(T2)導致菜用大豆的根瘤數與根瘤鮮質量均顯著下降,各時期平均降幅達36.06%和29.91%。而殼聚糖處理(T3)后,菜用大豆的結瘤數與根瘤鮮質量在整個處理期間均較T2顯著升高,平均增幅分別為T2的26.87%和25.63%。無鹽條件下,外源殼聚糖(T1)使菜用大豆的結瘤數與根瘤鮮質量在各處理時期均較CK顯著升高。說明NaCl脅迫會抑制菜用大豆結瘤,而殼聚糖處理在鹽脅迫和無鹽條件下均能顯著促進菜用大豆根瘤的形成與生長。

2.2 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖含量的影響

由圖1可知,NaCl脅迫(T2)下菜用大豆葉片蔗糖含量的變化較平緩,CK為先降低后升高再降低趨勢,其他條件下整體呈上升趨勢;根的蔗糖含量在CK和T2條件下整體呈先升后降的趨勢,而殼聚糖誘導后整體呈上升趨勢。T2處理使葉片的蔗糖含量在整個處理期間均較CK顯著升高,其中第30 天的增幅達CK的1.12倍;根的蔗糖含量在脅迫10 d顯著降低,其余時期均顯著高于CK。殼聚糖處理(T3)后,葉、根的蔗糖含量在各脅迫時期均較T2顯著升高,平均增幅分別為11.32%和21.32%,其中根在30 d的增幅高達43.89%。無鹽條件下,外源殼聚糖(T1)使葉、根的蔗糖含量均顯著高于CK。表明無論是在鹽脅迫還是無鹽條件下,外源殼聚糖均可誘導菜用大豆葉片蔗糖的合成,促進根部蔗糖的積累。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2—6同。

2.3 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉、根還原糖含量的影響

由圖2可知,隨時間延續,各處理葉片還原糖含量整體呈現先升高后降低的趨勢,而根的還原糖含量變化較平緩。NaCl脅迫(T2)導致菜用大豆葉、根的還原糖含量在各脅迫階段均顯著下降,尤其是根在脅迫中、后期的降幅較大,10,20,30 d的降幅分別達22.43%,21.92%,24.23%。殼聚糖處理(T3)后,葉、根的還原糖含量在各處理時期均顯著高于T2,平均增幅分別為10.22%,11.11%。T1條件下,菜用大豆葉、根的還原糖含量在整個處理期間均顯著高于CK。

圖2 NaCl脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆還原糖含量的影響

2.4 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖合成酶(SS)活性的影響

由圖3可知,NaCl脅迫(T2)使菜用大豆葉片和根的SS活性在整個處理期間均大幅升高,平均增幅分別達CK的1.15,1.17倍。殼聚糖處理(T3)后,葉片SS活性在脅迫10,20,30 d較T2顯著升高,增幅分別達T2的25.03%,25.59%,23.55%,其余時期無顯著差異;根的SS活性在各處理時期均顯著高于T2,在脅迫2,5,10,20,30 d較T2增幅分別為77.76%,35.41%,31.48%,45.97%,26.73%。T1條件下,葉片和根的SS活性在各處理時期均較CK顯著升高。

圖3 NaCl脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆蔗糖合成酶活性的影響

2.5 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的影響

由圖4可知,NaCl脅迫(T2)下,菜用大豆葉片SPS活性在處理第10,20,30天較CK顯著升高,其余時期無顯著差異;根的SPS活性在整個脅迫期間均顯著高于CK。與T2相比,T3處理使葉片SPS活性在脅迫第2,5,10天顯著升高,平均增幅達19.36%,其余時期差異不顯著;根的SPS活性在脅迫第2天時無顯著差異,在第5,10,20,30天均顯著升高,平均增幅為14.28%。T1條件下,葉片與根的SPS活性在各處理時期均顯著高于CK。

圖4 NaCl脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆蔗糖磷酸合成酶活性的影響

2.6 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉、根中性轉化酶(NI)活性的影響

由圖5可知,NaCl脅迫(T2)下,菜用大豆葉和根的NI活性均較CK顯著降低;殼聚糖處理(T3)后,葉和根的NI活性在整個脅迫期間均顯著高于T2,平均增幅分別為7.37%和9.48%,其中,葉在10,30 d、根在2,5,10 d接近CK水平。T1條件下,葉片NI活性在整個處理期間均顯著高于CK;根在10 d與CK相比差異不顯著,其余時期均較CK顯著升高。表明殼聚糖處理在鹽脅迫和無鹽條件下均能有效提高NI活性。

圖 5 NaCl脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆中性轉化酶活性的影響

2.7 殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉、根酸性轉化酶(AI)活性的影響

由圖6可知,NaCl脅迫(T2)使菜用大豆葉和根的AI活性在各脅迫階段均顯著降低;殼聚糖處理(T3)后,葉、根的AI活性均較T2顯著升高,其中,葉片在20,30 d的酶活性接近CK水平;根在5,10,30 d接近CK水平,2,20 d顯著高于CK,增幅達9.74%,9.99%。T1處理后,葉片在5,20 d、根在第2天酶活性與CK相比差異不顯著,其余時期均顯著高于CK。可見,NaCl脅迫顯著抑制了菜用大豆的AI活性,而殼聚糖處理則在鹽脅迫和無鹽條件下對葉、根的AI活性均產生了顯著的誘導作用。

圖 6 NaCl脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆酸性轉化酶活性的影響

3 結論與討論

3.1 NaCl脅迫下殼聚糖對菜用大豆葉片蔗糖代謝的影響

蔗糖作為光合作用的重要產物和長距離運輸的主要形式參與代謝,光合器官中蔗糖含量的多少直接影響其向“庫”端的轉移和積累,進而影響植物生長發育,對豆科植物而言,還會直接影響根瘤的形成與生長,最終影響產量。而葉片蔗糖代謝水平對“源”端的供應能力至關重要。本研究中,NaCl脅迫提高了菜用大豆葉片的SS和SPS活性,降低了NI和AI活性,導致葉片蔗糖含量升高,還原糖含量下降,而殼聚糖處理使NaCl脅迫下菜用大豆葉片SS、SPS和NI、AI活性均顯著升高,這與鹽脅迫下外源NO調控玉米葉片蔗糖代謝的結果相近[20]。作為早期的光合產物,葉片蔗糖含量的變化與光合效率密切相關。有研究發現,外源殼聚糖顯著提高了NaCl脅迫下菜用大豆的凈光合速率(Pn)[21],這就為葉片蔗糖的合成奠定了良好基礎。同時,葉片蔗糖含量變化還要受到蔗糖代謝途徑中關鍵酶綜合作用的影響。本研究中,菜用大豆蔗糖合成和降解的動態平衡受SS、SPS和NI、AI共同作用,殼聚糖通過誘導其活性整體升高,增強蔗糖合成和分解能力,促使蔗糖代謝高效運轉,這可能是NaCl脅迫下菜用大豆葉片蔗糖、還原糖含量升高的主要原因。此外,葉片蔗糖含量變化還與蔗糖向根部運轉有關,這需要在根中進一步說明。

3.2 NaCl脅迫下殼聚糖對菜用大豆根系蔗糖代謝及結瘤的影響

根在生長發育和形態建成過程中需要積累大量的碳化物,蔗糖是從“源”到“庫”的主要運輸形式?！皫臁逼鞴僬崽堑姆e累來自“源”端的轉運、自身合成及降解[22]。本研究發現,NaCl脅迫使菜用大豆根中NI、AI活性顯著下降,而殼聚糖處理顯著提高了其在NaCl脅迫下的NI和AI活性。NI、AI作為蔗糖從韌皮部卸出的主要驅動力,能夠在“源”端和“庫”端形成蔗糖梯度,加速蔗糖向“庫”端運輸和分配[23-24]。根中NI和AI活性升高,勢必增加“庫”強,進而增強蔗糖從葉片向根的轉運能力,促進蔗糖向根部的運輸;再者,由于殼聚糖處理顯著提高了NaCl脅迫下根系的SS、SPS活性,促使蔗糖分解、合成高效循環,致使根中蔗糖、還原糖含量整體升高。需要說明的是,“庫”強的增加反過來也可促進葉片蔗糖的合成[25],這也可能是殼聚糖促使葉片蔗糖代謝高效運轉的另一重要方面。糖類是根瘤在形成、生長過程中主要的碳源和能源。本研究中,外源殼聚糖使NaCl脅迫下菜用大豆根中蔗糖、還原糖含量升高,一方面為菜用大豆根系生長和結瘤提供了充足的碳源和能源,另一方面,蔗糖含量升高還可誘導結瘤基因表達,促進結瘤;同時,蔗糖、還原糖等可溶性糖作為滲透調節物質,其含量升高還可緩解鹽脅迫對根系的傷害,這可能是殼聚糖提高NaCl脅迫下菜用大豆結瘤能力的重要原因之一。值得注意的是,盡管NaCl脅迫使根中蔗糖含量升高,但根瘤數、根瘤鮮質量均顯著降低,這可能與還原糖含量下降有關,同時也說明還原糖可能是根瘤形成與生長過程中直接的碳源和能源。

豆科植物結瘤過程中會受到多種因素的影響,如根毛生長發育狀況,大豆異黃酮、生長素等結瘤信號物質代謝及其在根部積累等。鹽脅迫下,殼聚糖如何調控根毛生長發育和信號物質代謝及其在根部積累,還有待于進一步研究。

殼聚糖通過誘導NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖代謝高水平運轉,促進蔗糖向根部轉移,進而為根系生長和根瘤形成及生長提供較充足的碳源和能源,同時,高水平蔗糖也可促進結瘤基因表達;此外,蔗糖、還原糖等含量升高也有效緩解了鹽脅迫對根系的傷害,這可能是殼聚糖提高NaCl脅迫下菜用大豆結瘤能力的重要原因之一。