大蒜2個中性/堿性轉化酶基因AsNI的克隆與表達分析

周倩怡,黃思杰,田 潔

(1.青海大學 農林科學院,青海省高原種質資源研究與利用實驗室,青海 西寧 810016;2.生態環境部 南京環境科學研究所,江蘇 南京 210042)

蔗糖轉化酶是植物體內蔗糖代謝的關鍵酶,高等植物體內的蔗糖需要通過水解為己糖才能被吸收利用[1]。蔗糖從光合活性組織(主要為成熟的葉片)運輸到非光合作用的庫(如花、果實、根),進而被降解成為己糖等其他衍生物,用于各種生物過程[2]。轉化酶催化蔗糖的裂解將蔗糖轉化為葡萄糖和果糖,在植物的初級代謝中起著關鍵作用[1],蔗糖轉化酶不僅參與了植物的生長發育,還可以作為信號物質調節植物對非生物脅迫的抗性[3]。根據發揮作用的最適的pH,可分為酸性轉化酶(Acid invertase,AI)和中性/堿性轉化酶(Netural/alkaline invertase,NI)[4]。在之前的研究中,酸性轉化酶的功能及調控機制已經被廣泛報道,如酸性轉化酶可以調控碳同化物庫器官的發育和庫強調節[5],由于中性/堿性轉化酶活性不穩定,難以純化,導致人們對其功能知之甚少。最近的研究中,人們發現中性/堿性轉化酶在植物的生長發育過程中同樣具有至關重要的作用。目前,已經鑒定并從芒果[6]、番茄[7]、石斛[8]、木薯[9]等植物中克隆出中性/堿性轉化酶。Liu等[10]克隆得到3個橡膠中性/堿性轉化酶基因(HbNI),其中HbNI2表現出NI基因功能,其動力特征與蔗糖濃度呈正相關。在茶樹中鑒定出的中性/堿性轉化酶在非生物脅迫下提高了植株的抗性[11]。

大蒜(AlliumsativumL.)是百合科蔥屬植物,富含多種營養和藥用價值。蔗糖是大蒜糖積累的主要形式[12],其含量不僅是影響大蒜的風味品質的重要因素,也是植株抗逆性的體現[13]。樂都紫皮大蒜是青海特有品種,具有喜冷涼、產量高、品質好、商品性高的特點,但青海年平均溫度低,降水量少,會影響大蒜幼苗的生長發育[14]。目前,關于中性/堿性氧化酶對提高大蒜的抗逆作用研究較少,對大蒜的中性/堿性氧化酶基因的克隆及脅迫下表達模式也鮮有報道。本研究以樂都紫皮大蒜為試材,利用TA克隆法對AsNI進行克隆并進行生物學信息分析,分析這2個基因在不同脅迫處理下不同組織的表達模式,為探明逆境脅迫下大蒜AsNI基因的分子響應機制提供了一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗以樂都紫皮大蒜為材料,播種于栽培基質配比為草炭∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1的盆缽中,置于光照培養箱中進行培養。設置培養條件晝/夜:25 ℃/15 ℃,14 h/10 h;相對濕度70%;光照強度:300 μmol/(m2·s)。培養至大蒜苗高為12 cm左右時,進行分組培養處理:

正常培養(CK):培養條件不變,相對濕度保持70%,定期澆水保持土壤濕潤;干旱脅迫處理(DT):通過停止澆水進行人工控水[15],保持空氣相對濕度25%～30%,土壤濕度為45%左右,光周期及光照強度不變;低溫脅迫處理(CT): 將大蒜幼苗放置在晝/夜:4 ℃/4 ℃,14 h/10 h的培養條件下培養,相對濕度保持70%,定期澆水保持土壤濕潤,光周期及光照強度不變。

分別取對照、低溫脅迫處理(4,12,24 h)、干旱脅迫處理(1,6,9 d)大蒜根、假莖、鱗莖、葉片用于RNA的提取和cDNA的合成,上述采集樣品立即用液氮速凍,于-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 將采集的脅迫處理不同時期的大蒜組織材料的總RNA的提取利用TRNzol Universal(TRNzol Universal,DP424)總RNA提取試劑進行。采用1%瓊脂糖凝膠和TGem微量分光光度計(OSE-260,天根生化科技有限公司)分別檢測RNA完整性和質量。cDNA的合成按照HonorTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒進行。合成的cDNA放在-20 ℃冰箱進行保存備用。

1.2.2 大蒜AsNI基因的克隆 從大蒜基因組數據檢索得到2條中性/堿性轉化酶基因序列,據此設計克隆引物AsNI1-F(5′-ATGGCTTTAAGGGCTTCGCTCAC-3′)、AsNI1-R(5′-T CTAACCTGGCCAAGATCCTCCAT-3′)和AsNI2-F(5′-ATGGCTTTAAGGGCTTCGCTCA-3′)、AsNI2-F(5′-CTAACCTGGCCAAGATCCTCCA-3′)。PCR擴增模板為樂都紫皮大蒜假莖cDNA。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 30 s,進行35個循環;72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收產物,連接pMD19-T載體,轉化大腸桿菌感受態,選取單克隆進行菌液PCR驗證,陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 序列分析 蛋白質的理化性質通過Ex PaSy(https://web.expasy.org/protparam/)在線網站進行預測分析,跨膜結構域利用TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)在線網站分析。亞細胞定位和信號肽預測利用Softberry(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)和SignalP 3.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0)進行。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)和Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別進行蛋白質二、三級結構的預測。利用NetPhos 3.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)和NetNGlyc-1.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)預測AsNI蛋白的磷酸化位點和糖基化位點。利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)在線分析蛋白基序的保守性;使用 STRING網站(https://cn.string-db.org/)預測蛋白的相互作用網絡。在NCBI數據庫中獲得擬南芥等其他植物的NI序列,使用MEGA 6.0對系統進化樹進行測試和編輯,生成報告圖形。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測AsNI啟動子序列的順式作用元件。利用PlantRegMap網站(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)預測轉錄結合位點。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據熒光定量試劑盒(Unique AptamerTMQpcr SYBR?Green Master Mix)在Roche LightCycler?480 ℃上進行實時熒光定量PCR。參考Liu等[16]的研究,以大蒜CYP基因為內參基因,其引物序列為CYP-F(5′-AAGGACGAGAACTTCATC-3′)、CYP-R(5′-TCAATATCTCTCACCACTTC-3′);根據克隆得到序列設計引物AsNI1-F(5′-GGCGGTTATTTTGTTGGA-3′)、AsNI1-R(5′-ATAGATTGCTCGGGTGTA-3′)、AsNI2-F(5′-ATCTCCAGCCTGCTCACA-3′)、AsNI2-R(5′-TCCCATTTCTCTTCCATT-3′)。

1.3 數據分析

采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平[17]。顯著性差異采用SPSS的Duncan法(P<0.05)進行分析。圖表利用Origin 2021軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 大蒜轉化酶基因AsNI的克隆

以樂都紫皮大蒜的cDNA為模板,使用特異性引物AsNI1-F、AsNI1-R和AsNI2-F、AsNI2-R進行 PCR擴增,得到一條長度約為500 bp和一條長度約為1 200 bp的目的條帶(圖1),片段大小與預期一致。測序結果表明,AsNI1基因開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)全長522 bp,編碼173個氨基酸(圖2),AsNI2基因ORF全長1 203 bp,編碼400個氨基酸(圖3)。AsNI1基因與AsNI2基因ORF序列的相似性為26.25%。

*.終止密碼子。圖3同。

圖3 大蒜AsNI2基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 大蒜AsNI基因氨基酸序列分析

2.2.1 大蒜AsNI蛋白的理化性質分析及亞細胞定位預測 利用ExPaSy-ProtParam等對AsNI1與AsNI2基因編碼的蛋白質的理化性質進行分析(表1)。結果表明,2個蛋白均為親水性蛋白,均不穩定,AsNI1有18個磷酸化位點,AsNI2含有41個磷酸化位點;AsNI1未檢測到糖基化位點,AsNI2含有一個糖基化位點;亞細胞預測定位表明2個蛋白均位于細胞質。

表1 大蒜AsNI的蛋白質理化性質

2.2.2 大蒜AsNI的蛋白結構分析 利用SOPMA對蛋白進行蛋白質二級結構預測(圖4,5),結果表明,AsNI1二級結構包含的α-螺旋、延伸結構、β-轉角和無規則卷曲分別為43.00%,15.00%,6.25%和35.75%;AsNI2則分別包含45.09%,12.27%,2.31%和39.88%。利用Phyre 2軟件進行同源建模,并通過PyMOL軟件分析蛋白三級結構,其結果顯示AsNI1蛋白的三維結構由9個α螺旋和2個β折疊所構成;AsNI2蛋白的三維結構由15個α螺旋和4個β折疊所構成。

藍色.α螺旋;綠色.β轉角;黃色.無規則卷曲;紅色.延伸結構。圖5同。

圖5 AsNI2蛋白二級(A)、三級(B)結構預測

2.2.3 大蒜AsNI蛋白的保守結構域分析 利用MEME在線分析AsNI蛋白基序的保守性(圖6),結果表明,AsNI1和AsNI2均含有10個保守基序列,但結構相差較大,其中二者的3,9,10號基序相同且位置一致,AsNI1的4號與AsNI2的6號、5號與7號、7號與8號基序相同,但位置存在差異。通過NCBI網站的BlastP的程序對AsNI蛋白進行功能域分析,結果表明(圖7),AsNI1蛋白在1—172氨基酸位點間有Glyco_hydro_100結構域,AsNI2蛋白在1—399氨基酸位點存在Glyco_hydro_100結構域,此結構域是植物中性/堿性轉化酶的保守結構域。

圖6 AsNI蛋白的保守基序分析

2.2.4 大蒜AsNI的多序列對比和系統進化分析 利用NCBI BlastP對AsNI與其他植物的NI氨基酸序列進行同源性對比,選取相似度較高的幾個物種進行多重比較分析(圖8),AsNI1與AsNI2氨基酸序列的相似性為25.75%,AsNI1與擬南芥的相似性分別為86.71%;AsNI2與鐵皮石斛、野生稻、姜、玉米、高粱、黑麥草和短柄草的相似性分別為84.50%,85.50%,84.50%,85.25%,85.50%,86.00%和85.25%;表明大蒜與其他物種的AsNI的氨基酸序列具有較高的同源性,兩端與其他蛋白沒有相似性,且N端比其他蛋白少約110個氨基酸殘基。

利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法將大蒜與其他植物的NI構建同源進化樹(圖9)。結果表明,AsNI1與擬南芥屬于同一分支,在進化關系上最為接近,AsNI2與鐵皮石斛、野生稻和姜同屬一個大分支,親緣關系較為接近,AsNI1與AsNI2屬于不同分支,親緣關系較遠。

圖9 大蒜與其他作物NI氨基酸序列的系統進化樹

2.3 大蒜AsNI的蛋白互作網絡預測

利用STRING網站,以擬南芥為模板構建大蒜AsNI的蛋白互作網絡(圖10)。結果表明,AsNI1和AsNI2均與參與糖代謝的細胞壁轉化酶作用,但AsNI2與3種細胞壁轉化酶作用,多于AsNI1。此外,AsNI1也和參與氨基酸磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AT1G29720)、聚腺苷酸結合蛋白(PAB2、短柄草(XP_003558048.1∶222-620)、鳳梨(OAY70851.1)、柑橘(KAH9692069.1)、高粱(XP_002465359.1∶227-625)、姜(XP_042399050.1∶235-634)、蘆筍(XP_020247438.1)、木槿(XP_039002564.1)、擬南芥(KAG7589826.1∶297-469)、鐵皮石斛(AVA07409.1∶212-610)、小麥(XP_044375374.1)、野生稻(XP_006645848.2∶240-637)、黑麥草(XP_047072902.1∶223-621)、玉米(XP_008655058.1∶226-624)。

圖10 大蒜AsNI1和AsNI2的蛋白互作網絡

PAB8)和4-α-葡聚糖轉移酶(DEP1)相互作用。AsNI2與蔗糖合酶(SSA)、參與脫落酸形成的脫落酸缺乏酶(ABA4),糖介導的根系發育調控過程中的1-磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶(PIP5K9)也相互作用。

2.4 大蒜AsNI基因啟動子序列分析及轉錄因子結合位點預測

利用PlantCARE在線網站對2個AsNI基因進行啟動子元件預測分析,結果表明AsNI基因不僅包含典型的CAAT-box和TATA-box,還包含其他重要元件,部分重要元件見表2。AsNI1和AsNI2基因啟動子均具有多種逆境響應元件,但調控元件的種類和數量存在差異,如AsNI1和AsNI2的啟動子序列都含有干旱誘導的MYC結合位點,但數量上AsNI2比AsNI1多1個;AsNI2含有3種不同的逆境響應元件,而AsNI1只含有1種,且數量上少于AsNI2;AsNI1含有7種激素調節元件,AsNI2含有2種,但彼此之間的元件類型不同。

表2 AsNI基因啟動子部分順式作用元件

通過PlantRegMap在線網站以擬南芥為模板預測AsNI啟動子的轉錄因子結合位點。結果表明,AsNI1和AsNI2分別可以與31,28個轉錄因子家族具有結合位點,與順式作用元件預測結果相符,AsNI1和AsNI2均可以參與植物逆境調控的轉錄因子結合,如MYB、NAC、ERF等。其中,AsNI1與MYB家族的結合位點出現頻率最高,出現了28次。預測發現,AsNI1和AsNI2基因啟動子的正負鏈均分布有上述轉錄因子,推測該啟動子具有豐富的調控機制,控制基因的表達,并通過調節不同轉錄因子的轉錄起始參與行使不同的功能。

2.5 大蒜AsNI基因在不同組織和逆境條件下的表達分析

通過qRT-PCR對AsNI在大蒜不同部位的表達模式進行分析(圖11),結果表明,正常生長條件下,AsNI在大蒜的4個組織(根、假莖、鱗莖和葉片)中均有表達,其中AsNI1基因在根中表達量最高,分別比鱗莖、假莖和葉片高4.17,5.00,14.29倍,而AsNI2基因在鱗莖中表達量最高,分別比根、假莖和葉片高2.29,5.09,1.89倍。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

低溫脅迫下,大蒜不同組織AsNI1和AsNI2的表達模式差異顯著(圖12)。與脅迫前(CK 0 h)相比,低溫處理除了使根系AsNI1的表達量在脅迫12 h顯著提高以外,其他3個組織在整個處理期間均顯著下調。與之不同,低溫處理能夠顯著提高各部位AsNI2的表達量。同時,低溫下根、假莖、鱗莖、葉AsNI2的最大表達量分別比對照高4.75,2.18,3.16,14.51倍,即葉片AsNI2對低溫脅迫的響應較其他組織更強。綜上可得,低溫脅迫對AsNI2的誘導強于AsNI1,其中以葉片AsNI2對低溫逆境的響應更為明顯。

圖12 AsNI基因在低溫脅迫處理下不同組織相對表達水平

干旱脅迫對大蒜各組織AsNI1和AsNI2表達的影響具有顯著差異(圖13)。干旱處理下,AsNI1除了在假莖和鱗莖于脅迫6～9 d顯著高于對照以外,其他組織表達并未受到顯著上調表達。而對于干旱脅迫的AsNI2,其表達量在4個組織中均出現1個或多個顯著高于對照的時間點。其中,根、假莖、鱗莖、葉AsNI2的表達量分別于干旱處理1,1,6,1 d達到峰值,較對照高出5.01,1.06,1.41,1.10倍,即根系AsNI2對干旱脅迫的響應明顯強于其他組織。由此可知,與AsNI1相比,干旱脅迫對AsNI2的誘導更明顯;與其他組織相比,根系AsNI2對干旱逆境的響應更強。

圖13 AsNI基因在干旱脅迫處理下不同組織相對表達水平

3 結論與討論

植物在生長發育的過程中常常會遭受低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫,這會影響植物的正常生長發育以及農作物的生產力,因此,植物進化出多種調節機制來抵抗非生物脅迫[18]。研究表明,可溶性糖具有清除逆境脅迫下植物體內產生的ROS的功能[10],蔗糖作為主要的碳水化合物來源,運輸到庫器官后,在酶的作用下降解為己糖,供應庫器官的生長,如果實、根和塊莖[19],蔗糖降解產生的己糖是合成纖維素、蛋白質、果聚糖、淀粉和抗氧化物質所必需的[3]。轉化酶介導的蔗糖代謝不僅參與了植物的正常生長,還響應多種非生物脅迫[20]。玉米在中等水分脅迫下,其液泡轉化酶的活性會增強,表達量升高并促進己糖的積累[21]。Qi等[22]研究發現,NaCl和PEG處理下,甘薯根和葉中的中性/堿性轉化酶表達量增加。因此,轉化酶是植物生長發育和逆境響應的關鍵酶。本研究利用TA克隆法從大蒜基因組克隆了2個中性/堿性轉化酶基因,分別編碼173,400個氨基酸,2個基因的ORF和氨基酸序列差異較大,相似性分別為26.25%和25.75%。多重序列對比發現,AsNI蛋白兩端與其他蛋白沒有相似性,且N端比其他蛋白少約110個氨基酸殘基;AsNI1與擬南芥的相似性為86.71%,AsNI2與鐵皮石斛等物種的相似度為85.25%～86.00%,表明不同物種的中性/堿性轉化酶序列具有較高保守性。與本研究結果類似,Shen等[23]克隆了7個辣椒中性/堿性轉化酶基因,發現各基因編碼的蛋白質的氨基酸殘基數存在較大差異,從286—655個氨基酸殘基不等;錢文俊等[24]在分析茶樹中性/堿性轉化酶基因CsINV10的氨基酸序列時發現,CsINV10與其他物種的在氨基酸序列在N端和C端的同源性較低,但在中間的450個氨基酸具有較高的保守性。通過保守結構域分析發現這2個基因均含有糖苷水解酶100(GH100)家族典型的Glyco_hydro_100結構域;亞細胞定位預測2個基因均位于細胞質中,因此,AsNI1和AsNI2較大可能是細胞質中的中性/堿性轉化酶基因。蛋白質理化性質結果表明,AsNI2含有糖基化位點,而AsNI1未檢測到糖基化位點。糖基化對蛋白質起重要的修飾作用,可以通過糖基化調節蛋白質功能,因此,推測2個基因的功能有所差異。通過構建蛋白互作網絡預測發現,2個基因可能參與不同的生化過程,AsNI1可能主要參與蛋白質的磷酸化過程,而AsNI2可能參與糖代謝過程。

植物調控抗逆相關基因的表達依賴基因啟動子中特定的順式作用元件[25]。王運林等[9]克隆了木薯中性/堿性轉化酶基因MeNINV1的啟動子序列,發現其序列上存在激素相關響應順式作用元件,進而利用熒光定量證明外源激素調控MeNINV1基因的表達。楊梅等[26]鑒定并分離出水稻中一個受干旱脅迫誘導的基因Oshox24,實時熒光定量結果和GUS活性檢測均表明該基因強烈受到干旱脅迫的誘導并上調表達,其啟動子Oshox24P是干旱誘導型啟動子,積極響應植物的抗旱應答。通過對AsNI基因啟動子序列的順式作用元件預測分析,發現2條基因的啟動子區域除了包含 TATA-box 和 CAAT-box 等核心元件外,還包含逆境響應元件等。核心啟動元件TATA-box是決定基因轉錄起始的選擇,含有TATA-box的基因對轉錄起始較為敏感,CAAT-box調節轉錄起始的頻率,可以增強啟動子的強度[27],因此,可以推測AsNI的啟動子具有正常的轉錄功能;此外AsNI1和AsNI2含有不同種類及數量的逆境響應元件,推測AsNI1和AsNI2具有不同的逆境調控機制。啟動子上的轉錄因子結合位點是轉錄開始的關鍵部位,研究表明,轉錄因子結合位點具有保守性,相似的序列就可以結合同樣的轉錄因子[28-29]。預測結果表明,AsNI1和AsNI2的啟動子有多種轉錄因子結合位點,表明AsNI1和AsNI2可行使不同的基因功能。

在脅迫下,植物通過提高轉化酶基因的表達水平,促進蔗糖的水解,以此來緩解逆境損傷[30]。在本研究中,AsNI1和AsNI2在不同脅迫下具有不同的表達模式。低溫脅迫下,根系中AsNI1的表達量顯著提高,AsNI2在葉片中的響應更為明顯;干旱脅迫下,AsNI1在假莖和鱗莖中表達量顯著增加,AsNI2則以根系的響應最為強烈,且在2個脅迫下,AsNI2基因的響應程度均強于AsNI1。低溫破壞細胞膜的穩定性[31],植物光合作用的主要部位在膜結構上,低溫會降低光合相關酶的活性,抑制光合作用[32]。因此,低溫脅迫下葉片通過上調基因的表達以緩解逆境損傷。植物會通過合成滲透物質來抵抗脅迫,中性/堿性轉化酶通過將蔗糖分解為葡萄糖和果糖,參與調節滲透平衡,減輕逆境脅迫對植物的損傷。根系是植物應對干旱脅迫的關鍵器官[33],當植株遭受干旱脅迫時,根部加快可溶性糖的合成,并運輸至庫器官,彌補光合產量的降低[34],緩解逆境損傷。

本研究利用生物信息學的方法分析了2條AsNI基因的序列,綜合對比序列特征發現AsNI1與AsNI2在編碼氨基酸個數、糖基化位點個數、蛋白互作網絡、啟動子順式作用元件類型及轉錄因子結合位點等方面存在差異,因此,推測二者可能在逆境響應中表現出不同的功能;通過分析不同逆境脅迫下2個基因表達的變化趨勢,發現低溫和干旱處理下AsNI2的響應程度均強于AsNI1。其中,低溫脅迫主要誘導葉片AsNI2的表達,干旱脅迫以誘導根系AsNI2的表達為主。通過本研究結果表明,AsNI參與大蒜的逆境響應,為解析AsNI響應大蒜逆境脅迫的分子機制提供了理論基礎。