基于高通量測序的磷石膏上芒草內(nèi)部細(xì)菌多樣性分析

周煬　李劍峰　郭欣楊　張淑卿　倪明秀　張煜冕　郭金梅

周煬，李劍峰，郭欣楊，等.基于高通量測序的磷石膏上芒草內(nèi)部細(xì)菌多樣性分析[J].南方農(nóng)業(yè)，2023，17（11）：25-29.

摘 要 為了探究磷石膏堆渣上野生芒草（Miscanthus Sinensis）植株及種子內(nèi)部微生物組成情況，給今后磷石膏堆渣無害化處理、利用提供一定的依據(jù)，以貴州省開陽縣露天磷石膏堆場上生長芒草植株及種子為試驗(yàn)材料，通過高通量測序技術(shù)分析芒草植株及種子內(nèi)部微生物多樣性。結(jié)果共獲得123 363條有效序列，通過聚類獲得274個(gè)OTUs，屬于17個(gè)門42個(gè)綱148個(gè)屬；在門水平上，芒草植株、種子內(nèi)部的優(yōu)勢細(xì)菌門為藍(lán)菌門（Cyanobacteria_Chlfaxianoroplast），分別占59.03%、79.29%；在屬水平上，優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌（Sphingomonas）、鏈霉菌屬細(xì)菌（Streptomyces），分別占7%、2%。

關(guān)鍵詞 磷石膏；芒草；高通量測序；細(xì)菌多樣性；環(huán)境修復(fù)

中圖分類號：X592 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.11.007

磷石膏是濕法磷酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，主要成分為二水硫酸鈣，除此之外還有部分重金屬元素、可溶性磷酸鹽及氟化物等雜質(zhì)[1]。經(jīng)計(jì)算每生產(chǎn)1 t濕法磷酸，將排放出約5 t的磷石膏廢渣[2]。目前，國內(nèi)對于磷石膏利用率不足40%，大部分是通過堆存方式處理，這種處理方式不僅占據(jù)了大量的土地資源，而且其潛在的污染物泄露和垮堆風(fēng)險(xiǎn)也會對當(dāng)?shù)鼐用竦纳眢w和生態(tài)環(huán)境造成威脅[3]。磷石膏的低成本處理與有效利用始終是我國磷化工業(yè)的一大難題。

芒草（Miscanthus Sinensis）為禾本科（Gramineae）芒屬植物[4]，通常分布在熱帶、亞熱帶及溫帶亞洲地區(qū)。芒草在我國分布較廣，其對于環(huán)境的適應(yīng)能力非常強(qiáng)，在各種惡劣環(huán)境下都能夠生存[5]。目前已有將芒草應(yīng)用于重金屬土壤修復(fù)的相關(guān)研究報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)芒草能夠耐受一種甚至多種高濃度重金屬元素的脅迫[6]。貴州作為磷石膏生產(chǎn)排放的集中區(qū)域，且磷石膏的產(chǎn)出量在逐年增長，對于磷石膏的有效處理已成為當(dāng)今貴州乃至全國的熱點(diǎn)問題。目前，有關(guān)利用芒草植株修復(fù)磷石膏堆渣污染的相關(guān)研究報(bào)道還較為少見，因此具有較大的研究意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

2021年7月，在貴州省貴陽市開陽縣龍景灣貴州磷化集團(tuán)開陽露天堆場（東經(jīng)106.852 3°，北緯27.151 3°）采集磷石膏上生長的芒草植株和種子樣品，采集時(shí)芒草呈深綠色，群落單一，株高在0.4～1.2 m。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品處理

將植株根系挖出，用無菌水清洗表面后放入陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干，待植株風(fēng)干后與種子一同裝入無菌自封袋內(nèi)放入4 ℃冰箱暫存。

1.2.2? DNA提取及測序

根據(jù)試劑盒要求提取樣本的DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳測定DNA純度。采用16SrDNA對于V3-V4引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為（上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）PCR反應(yīng)參數(shù)：a. 1×（3 min at 95 ℃）b.循環(huán)數(shù)×30 s at 95 ℃；30 s at 55 ℃；45 s at 72 ℃）c.10 min at 72 ℃，10 ℃ until halted by user。根據(jù)各樣品的測序量，將其配置成對應(yīng)的配比，送至生工（上海）生物工程有限公司，利用Illumina公司的Miseq PE300，對其進(jìn)行高通量測序。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 細(xì)菌多樣性分析

2.1.1? 測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

如表1所示，樣品經(jīng)過高通量測序共獲得124 097條原始序列，經(jīng)對原始數(shù)據(jù)初步處理，獲得了123 363條有效的序列。供試樣本有效序列條數(shù)在51 383～71 980條，其中phps（芒草種子）有效序列條數(shù)大于php（芒草植株）。通過聚類一共獲得274個(gè)OTUS，通常將相似性值≥97%的序列定義為同一個(gè)OTUS。為了比較直觀地分析和統(tǒng)計(jì)，對于測序樣本的共有OTUS和特有OTUS進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，php與phps的共有OTUS有138個(gè)，php特有OTUS為66個(gè)，phps特有OTUS為70個(gè)，即php與phps的微生物群落組成較為相似。

2.1.2? α多樣性

樣品稀釋曲線傾斜度在不斷降低逐漸趨于平緩（見圖1），同時(shí)樣品中測序覆蓋度均為1（見表2），說明測序數(shù)據(jù)量比較合理，基本上能夠反映出樣品細(xì)菌群落的組成情況[7]。通過計(jì)算Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)等三個(gè)指標(biāo)結(jié)果表明，php細(xì)菌多樣性大于phps。

Rank Abundance曲線圖能夠直觀明確地展示各樣本中OTUS的均勻度及豐富度，如圖2所示，當(dāng)OTU數(shù)量小于100時(shí)，php與phps的物種相對豐度較高，但曲線下降速度比較快，說明php與phps的分布均勻程度較低。當(dāng)OTU數(shù)量超過100的情況下，物種的相對豐度較低，但是曲線比較平坦，表明物種分布較為均衡。圖中php與phps樣本間的曲線寬度、平滑程度都比較一致，表明其物種豐度及均勻度都無顯著差異。

2.1.3? 樣本主成分

通過主成分（PCA）分析可知，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）貢獻(xiàn)率分別為58.23%和40.5%，合計(jì)為98.73%。如圖3所示，兩樣本點(diǎn)的距離十分接近，且位于第一象限有明顯的聚集，表明php與phps的細(xì)菌相似性較高。

2.2? 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

2.2.1? 門水平下陳化磷石膏上生長芒草植株及種子細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

在門水平下，一共鑒定出17個(gè)門類細(xì)菌，如表3所示，豐度低于1%的細(xì)菌門合并為Others，其中，芒草植株（php）及種子（phps）共有的優(yōu)勢細(xì)菌門為藍(lán)菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）。如圖4所示，藍(lán)菌門細(xì)菌在芒草植株、種子內(nèi)部的相對豐度分別為59%、79.3%，即藍(lán)菌門的相對豐度phps大于php。原因可能是：1）種子相對于植株而言，營養(yǎng)物質(zhì)積累較多，較多的營養(yǎng)物質(zhì)有利于藍(lán)菌門的生長，所以種子內(nèi)部的藍(lán)菌門豐度較大；2）在細(xì)菌功能方面，藍(lán)菌門的菌類具有較強(qiáng)的抗紫外線輻射能力，在較強(qiáng)紫外線的輻射下能夠形成一種代謝響應(yīng)機(jī)制，使其適應(yīng)紫外輻射的脅迫[8]。

2.2.2? 屬水平下陳化磷石膏上生長芒草植株及種子細(xì)菌相對豐度

在屬水平下，共檢測出148個(gè)屬的細(xì)菌，在芒草植株中鏈型植物（Streptophyta 59%）占比最大，其次是未知菌屬細(xì)菌（unclassified_Bacteria 39.5%）；鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas 0.07%）為植株菌群內(nèi)部的重要細(xì)菌群落，在芒草種子（phps）中占比最大的同樣為鏈型植物（Streptophyta 79.2%），其次為未知菌屬（unclassified_Bacteria 19.8%）。如表4、圖5所示，在植株到種子過程中，其內(nèi)部鏈型植物、未知菌豐度逐漸增大，但鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬等細(xì)菌豐度相對減少。鏈型植物占比較高的原因可能為芒草植株及種子內(nèi)部葉綠體信息沒有被排除，導(dǎo)致測序結(jié)果中鏈型植物數(shù)據(jù)占了絕大部分。芒草植株之所以能夠在磷石膏上生長，原因可能是鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬細(xì)菌對植物的生長也起著一定的促進(jìn)作用。鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌常被研究者用于修復(fù)重金屬污染土壤[9]。

2.3? 16s功能預(yù)測分析

如圖6所示，在php與phps中，其功能性強(qiáng)的前五類均為：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、由CheY樣受體域和翼螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的響應(yīng)調(diào)節(jié)劑、藍(lán)藻中保守的未表征蛋白質(zhì)、未表征的低復(fù)雜度蛋白質(zhì)，且種子內(nèi)部功能豐度值高于植株。其中植株與種子中功能性最強(qiáng)的均為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶。組氨酸激酶可以作為細(xì)菌細(xì)胞中的重要信號感知分子，細(xì)菌可以利用組氨酸激酶來感受胞外環(huán)境的變化，作為一種自身具有激酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶活性的多功能酶，組氨酸激酶能夠作為信號分子的細(xì)胞受體，且具有跨細(xì)胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)信號在細(xì)菌、酵母菌和高等植物中都有發(fā)現(xiàn)[10-11]。

3? 討論與結(jié)論

本研究以磷石膏上芒草植株和種子為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對微生物多樣性進(jìn)行細(xì)致研究，結(jié)果顯示：在門水平上，其共同的優(yōu)勢菌門是藍(lán)菌門。在屬水平上，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌（Sphingomonas）、鏈霉菌屬細(xì)菌（Streptomyces）為優(yōu)勢菌屬，且php中兩種優(yōu)勢細(xì)菌相對豐度高于phps。這兩種細(xì)菌在植物生長及抗逆性方面都起著較為重要的作用。黃媛林等對一株紅樹林鏈霉菌所產(chǎn)抑菌活性化合物的分離及其生物合成基因簇的研究表明，鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物具有多種抗性的功效，且多被用作生物防治劑[12]。何曉紅等對鞘氨醇單胞菌的各項(xiàng)功能的綜述研究表明，鞘氨醇單胞菌能夠耐受惡劣環(huán)境及貧瘠營養(yǎng)環(huán)境，且能夠促進(jìn)植物生長與抵抗多種植物病原菌[13]。

目前，鏈霉菌屬與鞘氨醇單胞菌屬已廣泛用于重金屬污染的土壤植物與植物促生菌的聯(lián)合修復(fù)研究[14]，微生物環(huán)境修復(fù)仍然是目前研究的熱點(diǎn)問題之一。然而現(xiàn)階段對于磷石膏的處理利用及其內(nèi)部元素對于環(huán)境污染的系統(tǒng)研究還比較缺乏，這些都將成為未來磷石膏堆渣污染研究的重要課題。芒草植株能夠在磷石膏堆渣上面生存的原因可能是由于鏈霉菌與鞘氨醇單胞菌的存在，這兩株細(xì)菌具備開發(fā)成為磷石膏堆渣治理與利用的植物促生菌的潛在價(jià)值，值得進(jìn)一步開發(fā)與研究。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）