寶根續筋藥貼經皮給予的急性毒性、刺激性和過敏性研究

梁艷 伍春梅 陳婉月 張憲哲 張敬文 宋映蓮 趙美玲 王張 何浚治

【摘 要】 目的：評價寶根續筋藥貼經皮膚給藥后的急性毒性、刺激性以及過敏性。方法：在急性毒性實驗研究中將兔按性別和體重隨機分為空白對照組和寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量組，選擇最大給藥量［即405.151 mg·（cm2·d） -1］，觀察和記錄動物一般狀況，死亡情況、體重和飼料消耗量，測試血常規和血生化指標。在刺激性實驗研究中給予寶根續筋藥貼浸膏0.5 mL［劑量為67.525 mg·（cm2·d）-1］，按評分標準對皮膚紅斑和水腫進行評分，并進行統計學處理。在豚鼠主動皮膚過敏性實驗研究中將寶根續筋藥貼浸膏0.2 mL［即27.0101 mg·（cm2·d）-1］，觀察動物是否有嚴重的全身性過敏反應出現。結果：觀察期內未見動物死亡、中毒癥狀和肉眼可見的臟器異常，體重和飼料消耗量無明顯變化，但急性毒性實驗中部分血細胞指標（紅細胞數、血紅蛋白、紅細胞壓積數、白細胞數和中性粒細胞數）和血液生化指標（總膽固醇含量）出現異常，皮膚未見刺激性及過敏性。結論：寶根續筋藥貼浸膏經皮膚給藥后未見明顯的急性毒性、刺激性和過敏性，安全性良好，但在臨床使用時仍需監測血常規和血液生化學指標。

【關鍵詞】 寶根續筋藥貼；皮膚給藥；急性毒性；刺激性；過敏性

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2023）15-0015-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202315005

Abstract：Objective To evaluate the safety of acute toxicity， pungency and irritability of Baogenxujin Paste after skin administration.Method Rabbits were randomly divided into blank control group and Baogenxujin paste 45.76 times clinical dose group according to gender and body weight. The maximum dose ［405.151 mg·（cm2·d） -1］ was selected. The general condition， death， body weight and feed consumption of the animals were observed and recorded.Blood routine and biochemical parameters were tested In the experimental study of pungency， Baogenxujin paste was given 0.5 mL ［67.525 mg·（cm2·d）-1）］. Skin erythema and edema were scored according to the scoring standard， and statistically processed. In the active skin allergy experimental study of guinea pigs， Baogenxujinpaste 0.2 mL ［27.0101 mg·（cm2·d）-1］ was used to observe whether the animals had severe systemic allergic reactions.Result During the observation period， there were no animal death， poisoning symptoms and organ abnormalities visible to the naked eye， and there were no significant changes in body weight and feed consumption;but part of the blood cells in acute toxicity experiment indicators （red blood cell count， hemoglobin， red blood cell pressure accumulation of， leukocyte count and neutrophil） and blood biochemical indicators （total cholesterol） is abnormal， the skin is not allergic and irritating.Conclusion After skin administration of Baogenxujin Paste，the safety is good， but we still need to pay attention to the monitoring of blood routine and blood biochemical indexes.

Keywords：Baogenxujin Paste; Skin Administration; Acute Toxicity; Pungency;Irritability

蒙醫制劑寶根續筋藥貼（曾用名：舒筋續斷藥貼）為外用的貼膏劑，以接骨木、當歸和續斷為君藥，臣以防風和白芷，佐以紅花和紅毛五加皮，并以醋乳香和醋沒藥為使，共同發揮活血通絡、續筋接骨、通“白脈”的功效，主治骨關節及軟組織損傷中后期。根據《中國藥典》（2020年版）記載當歸、續斷等均可用于“風濕痹痛，跌撲損傷”［1］。接骨木總黃酮、花青素、木質素及續斷皂苷Ⅵ可抗骨質疏松［2-5］；當歸多糖APF2可促進分泌造血生長因子［6］；紅花黃色素及紅毛五加皮中的多糖、皂苷和萜類物質可以鎮痛［7-11］；沒藥甾酮可抗炎［12-13］；乳香可緩解關節炎患者疼痛僵硬［14］。

根據《醫療機構制劑注冊管理辦法》（征求意見稿， 2015年）［15］，藥物研究技術指導原則（2005年）［16-18］、《四川省醫療機構制劑研究技術指南（試行版）》（2014年）［19］，寶根續筋藥貼擬申請四川省醫療機構中藥制劑批文，需開展急性毒性、刺激性和過敏性實驗研究并提供資料。因此參考相關專著［20］開展系統安全性評價，為寶根續筋藥貼申請四川省醫療機構制劑批文提供技術支撐，為其后續有效性研究及臨床安全合理應用奠定基礎。其作為外用制劑，十分有必要開展皮膚刺激性和過敏性等基本的安全性評價實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 寶根續筋藥貼為外用的貼膏劑，其臨床成人日用劑量為0.0088542 g浸膏/cm2，亦即0.02083 g藥材/cm2，臨床最長用藥周期為21d。本實驗直接使用浸膏（稠膏），含量為2.3529 g藥材/g浸膏，密度為1215.4530 mg浸膏/mL浸膏（與藥貼僅為有無壓敏膠的區別，因此本實驗直接采用浸膏作為受試物），生產批號為210101。外用，每日貼1張藥貼。藥貼面積為12 cm×16 cm，每張藥貼含1.7 g浸膏，相當于4 g藥材。寶根續筋藥貼的臨床給藥途徑為外用于非破損皮膚，故本次實驗采用與臨床給藥途徑相似的皮膚外用途徑。2，4-二硝基氯代苯（C6H3ClN2O4，過敏性實驗用陽性對照藥）：由Xiya Chemical Industry Co.， Ltd Shangdong出品，規格：100g/瓶，AR級，純度99%，批號為W5656。用70%乙醇配成濃度為1%和0.1%的溶液備用。

1.2 動物 新西蘭大白兔，普通級，12只，雌雄各半，體重為2.0～2.5 kg，《四川省實驗動物質量合格證》號：No.0043044；8只，雌雄各半，體重為1.8～2.2 kg，《四川省實驗動物質量合格證》號：No.0042956。均由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2019-031。英國種豚鼠，白色，普通級，30只，雌雄各半，體重250～300 g，由四川省實驗動物專委會養殖場提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2018-14，《四川省實驗動物質量合格證》號：No.0020374。

1.3 試劑 血常規測試用試劑：溶血劑（批號V-28CFL）、稀釋劑（批號M-3D）、清洗劑（批號V-28R）。血液生化指標測試用試劑盒：總蛋白（TP）（批號140819004）、白蛋白（ALB）（批號148320006）、總膽固醇（TC）（批號141620009）、甘油三脂（TG）（批號141720008）、總膽紅素（T-bil）（批號144420002）、葡萄糖（GLU）（批號141520016）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）（批號140119009）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）（批號140219006）均來自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.4 儀器 獸用全自動血液細胞分析儀（型號BC-2800Vet，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司生產）；獸用生化分析儀（型號BS-240VET，由深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司生產）。

1.5 實驗方法 急性毒性實驗：將兔按性別、體重分層［18］后再隨機分為空白對照組和寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量組，即405.1510 mg·（cm2·d） -1，亦即953.296 mg藥材/cm2/d，每組 6只兔，雌雄各3只。僅在第一天內給藥3次（8點、14點、20點，每次間隔6 h），每次1.0 mL，給藥面積為9 cm2。藥物敷貼4 h后將貼敷處簡單洗凈，自然風干。其后連續觀察14 d，期間觀察和記錄動物一般狀況、死亡情況、體重和飼料消耗量，最后一天處死動物后測試血常規和血生化指標。

刺激性實驗：采用同體對照法，共8只兔，雌雄各4只［18］。兔的背部右側剃毛區給予純凈水0.5 mL，作為對照；背部左側剃毛區給予寶根續筋藥貼浸膏0.5 mL［劑量為67.5252 mg·（cm2·d） -1］，相當于臨床成人日用劑量的7.63倍，每側給藥面積為9 cm2；每天給予一次，連續10 d；每天觀察并記錄給藥前、給藥后1 h及末次給藥后30 min、60 min、24 h、48 h、72 h和96 h皮膚的紅斑及水腫、涂敷部位是否有皮膚異常情況。

皮膚過敏性實驗：豚鼠30只，按性別、體重分層［18］后再隨機分為3個組，即空白對照組、陽性對照藥組和寶根續筋藥貼浸膏組；每組10只動物，雌雄各5只。致敏接觸階段，在實驗第0天、第7天和第14天時，將寶根續筋藥貼浸膏0.2 mL（即27.0101 mg/cm2/次，亦即67.5252 mg藥材/cm2/d，相當于成人臨床日用劑量為8.8542 mg浸膏/cm2的3.05倍）均勻涂布于豚鼠背部已去毛背部左側皮膚上，陽性對照藥組使用1%的2，4-二硝基氯代苯溶液，給藥體積為0.2 mL/次，給藥面積為9 cm2，故給藥劑量為0.2222 mg/cm2/次，空白對照組給予純凈水。激發接觸階段，第28天時將寶根續筋藥貼浸膏0.2 mL分別均勻涂布于豚鼠背部已去毛右側皮膚上一次，陽性對照藥組使用0.1%的2，4-二硝基氯代苯的溶液，給藥體積為0.2 mL/次，給藥面積為9 cm2，故給藥劑量為0.02222 mg/cm2/次，空白對照組給予純凈水。連續觀察四天，記錄各時間點時動物皮膚過敏反應程度，同時密切觀察動物是否有全身性過敏反應出現。

1.6 統計學方法 計量資料的數據一般以平均值加減標準差（x±s）表示。組間差異的顯著性檢驗運用SPSS 20.0 for windows軟件提供的非參數檢驗或單因素方差分析方法。計數數據一般采用非參數檢驗進行組間的差異性比較。P<0.05為均數間的差異有統計學意義，P<0.01為均數間的差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 急性毒性

2.1.1 死亡情況、一般狀況和尸檢結果 空白對照組和寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量組共12只兔，死亡0只，給藥時動物無異常；在給藥后當天、第2天、第7天和第14天時，對各組兔進行一般觀察，在給藥后14 d的觀察期內，兩個組的外觀體征和尸解情況均無異常。

2.1.2 體重及飼料消耗量 空白對照組和寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量組的雌、雄兔14d內體重均自然增加。寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量對兔體重及飼料消耗量沒有明顯的影響。詳見表1、表2。

2.1.4 血液學指標 寶根續筋藥貼浸膏使雄性兔給藥后第14天的紅細胞數目、血紅蛋白和紅細胞壓積數量減少，雌性兔在給藥后第14天的白細胞數和中性粒細胞數減少，其余各項血液學指標均無明顯的變化。見表3和4。

2.1.5 血液生化學指標 寶根續筋藥貼浸膏使雌性兔在給藥后第14天的總膽固醇含量升高，其余各項血液生化學指標均無明顯的變化；此外，雄性兔的血液生化學指標均無明顯的變化。見表5。

2.2 皮膚刺激性

2.2.1 死亡情況、一般狀況和尸檢結果 在給藥前及首次給藥后14 d期間，對每只動物進行一般狀況觀察，兔的外觀體征均無異常及各種活動亦無異常。寶根續筋藥貼浸膏皮膚刺激性研究中8只兔在給藥前及首次給藥后14 d期間均未見動物死亡；麻醉處死后解剖動物的各個臟器亦未見肉眼可見異常。

2.2.2 體重及飼料消耗量 雄8只兔在給藥前及首次給藥后14 d期間的體重均自然增加。見表6。雌雄8只兔在給藥前及首次給藥后14天期間的飼料消耗量大體上呈現先增加后減少的趨勢，但均無明顯的差異（P>0.05）。見表7。

2.2.3 皮膚刺激性結果 寶根續筋藥貼浸膏連續給予兔背部皮膚10 d，8只動物均未見任何紅斑、水腫等皮膚刺激性反應，涂敷部位皮膚異常，停藥后觀察4 d期間亦未見任何延遲性皮膚刺激性反應。

2.3 皮膚過敏性

2.3.1 體重及飼料消耗量 空白對照組、陽性對照組和寶根續筋藥貼浸膏組的豚鼠32 d內體重均自然增加。見表8。寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量對豚鼠飼料消耗量沒有明顯的影響。見表9。

2.3.2 皮膚過敏性反應 空白對照組豚鼠的皮膚在“致敏接觸階段”和“激發接觸階段”時，沒有紅斑、水腫或全身過敏等過敏反應，故純凈水對豚鼠皮膚無致敏性。

陽性對照組（2，4-二硝基氯苯）豚鼠的皮膚實驗前均正常。在“致敏接觸階段”， 實驗第18～23天出現“可見紅斑，輕度水腫，勉強可見”等中度致敏性；實驗第24～27天出現“重度紅斑；中度水腫，明顯可見（邊緣高出周圍皮膚）”“紫紅色紅斑到輕度焦痂形成；嚴重水腫，皮膚隆起1 mm以上或有水泡、破潰”等中度致敏性。在“激發接觸階段”，激發性給藥后第0.5小時出現“豚鼠呼吸加快，豎毛，活動增加”等中度致敏性，6 h及24 h后豚鼠給藥部位皮膚出現“勉強可見的輕度紅斑”等中度致敏性，48 h后豚鼠給藥部位皮膚出現“明顯可見的中度紅斑和水腫”等中度致敏性，72 h后豚鼠給藥部位皮膚的“紅斑與水腫逐漸消失”等，96 h后豚鼠給藥部位皮膚的“紅斑與水腫基本消失，破潰處結痂”等。故2，4-二硝基氯苯對豚鼠皮膚有中度致敏性，主要表現為皮膚紅斑、水腫和呼吸加快、豎毛、活動增加，呈現“致敏接觸階段由輕到重，隨后激發接觸階段再逐步緩解”的“時-毒關系”。

寶根續筋藥貼浸膏組豚鼠的皮膚在“致敏接觸階段（28 d）”和“激發接觸階段（4 d）”時，沒有紅斑、水腫或全身過敏等過敏反應，故寶根續筋藥貼浸膏對豚鼠皮膚無致敏性。

3 討論

有研究者［21］認為，在外用實驗中由于受給藥部位的限制，不少中藥外用制劑的量效關系并不明顯；原則上動物實驗外用劑量有一個與臨床外用是等效劑量。針對皮膚用藥的特點，經多次試驗和分析認為，動物與人等面積用藥量一致就是等效劑量，成人的給藥劑量為“1.7 g浸膏除以192 cm2（12 cm×16 cm）”，即為0.0088542 g浸膏/cm2，亦即0.02083 g藥材/cm2；參考上述文獻中提出的“動物與人等面積用藥量一致就是等效劑量”的理論，兔的等效劑量亦為8.8542 mg浸膏/cm2，亦即20.83 mg藥材/cm2。在急性毒性中，對于給藥面積沒有選擇文獻中動物體表面積的10%（約為0.0150 m2）原因是面積過大可能引起動物著涼，進而導致動物死亡，且給藥劑量以單位面積的載藥量來計算，與剃毛面積大小無關，因此背部給藥區域面積采用為9 cm2；對于兔皮膚的最大給藥體積問題，由于一定面積的皮膚對藥物吸收有限，超過一定限值后增加藥物也無法明顯增加吸收。根據前期預實驗，1.0 mL的給藥體積剛好能覆蓋面積為9 cm2的兔背部皮膚，同時為滿足急毒實驗最大給藥劑量的要求，一日給藥三次，因此一日內的最大給藥體積為3.0 mL·d-1。

寶根續筋藥貼組方以接骨木、當歸、續斷、防風、白芷、紅花、紅毛五加皮、醋乳香和醋沒藥組成。《現代中藥毒理學》［22］記載接骨木的藥性為有小毒。但現代研究對于其外用的毒性研究較少，并未有研究證明接骨木外用有毒性，且在安全性評價實驗中并沒有發現接骨木急性毒性、刺激性以及過敏性。在兔急性毒性實驗中，與空白對照組比較，雖然寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量組雄性兔的紅細胞數目（6.05±0.09）、血紅蛋白數目（132.33±0.47）以及紅細胞壓積（40.27±0.57）顯著降低（P＜0.05），雌性兔的白細胞數（5.53±0.37）及中性粒細胞數（2.20±0.28）十分顯著降低（P＜0.01），雌性兔的總膽固醇含量（1.54±0.08）十分顯著的升高（P＜0.01），但是均在臨床參考的正常范圍內（紅細胞數5.00～7.60，血紅蛋白數目105～170，紅細胞壓積31.0～46.0，白細胞數5.2～13.5，中性粒細胞數2.0～7.5），即上述變化雖有統計學意義，但不具有臨床意義。因此，寶根續筋藥貼臨床上外用安全，但仍應當根據具體情況考慮進行血常規和血液生化學指標的監測。

新西蘭大白兔背部完整皮膚在24 h內分3次接觸寶根續筋藥貼浸膏45.76倍臨床劑量后，在14 d內未見明顯的不良反應；該劑量為臨床成人日用劑量的45.76倍，從而提示寶根續筋藥貼浸膏的毒性低，經皮用藥安全；對兔正常皮膚無刺激性，且未見任何延遲性反應，屬于“無刺激性”范疇。外用于豚鼠后無皮膚致敏性，不導致皮膚紅斑、水腫或全身過敏等過敏反應。總之，寶根續筋藥貼外用安全。

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（收稿日期：2022-11-15 編輯：劉 斌）

基金項目：四川省應用基礎研究計劃項目（2019YJ0286）：歸芪健骨藥貼治療骨質疏松癥的作用機制研究。

作者簡介：梁艷（1998—），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥理論與應用研究。E-mail： 709489716@qq.com

通信作者：王張（1980—），男，漢族，博士，教授，研究方向為民族藥藥理學研究。 E-mail：wzcqcd@163.com