基于網絡藥理學探討銀杏葉抗肝癌的作用機制①

滕 楊,劉玉雙,周海瑞,張 杰,焦淑清,倪 蕾

(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

肝癌(hepatocellular carcinoma)作為全球最普遍的實體器官惡性腫瘤之一,分為原發性性肝癌和繼發性肝癌[1]。具有初期確診艱難、進展快、手術后危險因素大[2]和預后差的特點,所以對肝癌進行一級預防以及尋找新的治病藥物是當下的研究熱門。中藥作為綜合性醫治的核心構成部分具備與眾不同的醫治優點[3],不但能抑制肝癌細胞分化,加快肝癌細胞的凋亡[4],同時也能夠抑制肝癌細胞的侵擾和遷移,提升肝癌病人的免疫能力、改善肝癌細胞的多藥耐藥,實現了從多層次、多環節、多途徑、多靶點發揮抗肝癌的作用[5]。

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(ginkgo biloba L.)的干燥葉[6],所含的關鍵化學成分有黃酮類(flavonoids)、萜類(terpenes)、銀杏醇(ginnol)、莽草酸(shikimic acid)等。據《食療本草》記述,銀杏葉味淡,微辛,甘、苦、澀、平,入心肺功能經[7,8]。可用于斂肺止喘、活血化瘀、活脈止痛、化濁降血脂[9],還有保護肝臟,促使肝臟機能充分發揮的特殊功效[10]。本研究主要是采用網絡藥理學的方法預測出銀杏葉治療肝癌的有效活性成分、核心作用靶點,進行GO和KEGG通路富集分析,再通過分子對接的方法模擬化合物與疾病靶點間的結合活性,為銀杏葉抗肝癌作用機制提供了一定的理論依據,并為中藥治療肝癌提供參考思路。

1 數據庫與軟件

1.1 數據庫

TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php);UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/);Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/);Drug Bank數據庫(https://www.drugbank.ca/);OMIM數據庫(http://www.omim.org/);Genecards數據庫(https://www.genecards.org/);Metascape分析平臺(https://metascape.org/);Cytoscape分析平臺(https://www.cytoscape.org/);STRING分析平臺(https://string-db.org/);微生信平臺(https://string-db.org/)。

1.2 軟件

Auto Dock Tools軟件(https://autodock.scripps.edu/);PyMOL軟件(https://pymol.org/2/)。

2 實驗方法

2.1 銀杏葉作用靶點以及肝癌疾病靶點的篩選

篩選標準:DL≥0.18、OB≥0.30[11],使用TCMSP數據庫,以銀杏葉為搜索詞,篩選出其活性成分,在Swiss Target Prediction數據庫中查找對應的靶點。同時,在Uniport數據庫中限定物種為人類,選擇已驗證過的靶點基因,除去沒有靶點和重復的活性成分。通過DrugBank、OMIM、Genecards三個疾病靶點數據庫得到HCC相關靶點,導入Uniport,再次選擇人類物種和以驗證過的蛋白,刪去重復值得到疾病靶點數據庫。

2.2 藥物-疾病-靶點的確定

將銀杏葉和疾病靶點導入Venny 2.1.0分析平臺,得到78個共同靶點并繪制Venn圖。

2.3 核心網絡的確定以及蛋白質相互作用網點(PPI)的構建

使用String數據庫建立PPI網絡,除去游離靶點,通過Cytoscape3.9.1進行可視化,使用軟件中“Network Analyzer”來分析成分疾病網絡靶點的屬性值,計算節點的介度值(Betweenness)來構建PPI網絡圖。

2.4 成分-疾病-靶點網絡的構建

通過整理銀杏葉與肝癌相同靶點,得到Network和Type文件,導入Cytoscape3.9.1數據庫,節點代表作用靶點、活性成分和疾病,通過改變節點大小,繪制成分-疾病-靶點網絡圖。

2.5 GO生物過程和KEGG通路富集分析

在String平臺查找到的蛋白靶點,以度值>30為條件得到10個核心靶點,將其輸入Metascape中,分別對核心靶點進行GO和KEGG分析,將結果導入微生信制作富集氣泡圖。

2.6 核心活性成分-關鍵作用靶點分子對接

在Pub Chem數據庫下載成分的二維結構并存為SDF文件,使用Chem Bio 3D軟件將核心活性成份轉化成PDB格式,導入Auto Dock軟件將PDB轉化成PDBQT;在PDB數據庫下載關鍵靶點蛋白的3D結構并保留為PDB文件;用PyMOL軟件去掉水分子和配體。將處理好的的關鍵靶蛋白儲存為PDB格式導入Auto Dock軟件,對分子進行常規化處理并進行分子對接,最終用PyMOL進行對接結果可視化。

3 實驗結果

3.1 銀杏葉活性化學成分與作用靶點匯總以及肝癌疾病靶點篩選

使用TCMSP數據庫并根據OB值和DL值篩選得到可以進行研究實驗的活性成分10種(YXY1-YXY10),主要含有木犀草素-4'-葡萄糖苷、丁香素和芝麻素等,銀杏葉有效成分匯總見表1。在DrugBank、OMIM、Genecards三個疾病靶點數據庫中篩選疾病靶點,將得到數據輸入Uniport數據庫對蛋白質進行標準化處理,刪去重復靶點名稱,得到與疾病相關靶點共1637個。

表1 銀杏葉活性有效成分匯總

3.2 藥物-疾病交集靶點Venn圖

將藥物和疾病靶點導入Venny2.1.0平臺中,得到交集靶點78個,制作藥物-疾病靶點交集圖,見圖1。

圖1 銀杏葉活性有效成分基因與肝癌基因Venn圖

3.3 核心網絡的確定以及蛋白質相互作用網點(PPI)的構建

將藥物-疾病交集靶點導入String平臺中,設置置信度≥0.4,刪去兩個無蛋白作用靶點,構建“YXY-HCC”的PPI網絡,將Stv文檔導入Cytoscape3.9.1中進行數據分析,得到PPI網絡圖,按照Betweenness值大小逐一排列,其中藍色表示相對重要靶點名稱,見圖2。

圖2 銀杏葉活性化合物-肝癌疾病共有靶點基因PPI網絡

3.4 有效成分-疾病-靶點網絡的構建

將成分與疾病相同靶點整理為Network和Type文件,將其導入Cytoscape3.9.1分析平臺進行繪圖。其中倒三角形表示銀杏葉藥物,圓形表示銀杏葉活性成分,正八邊形為肝癌疾病,菱形與長方形為作用靶點,其中顏色深的為核心作用靶點,見圖3。

圖3 銀杏葉活性成分-肝癌疾病-靶點網絡圖

3.5 核心靶點的GO富集分析和KEGG富集分析

在本研究中,10個核心靶點共得到了30個GO注釋和10個KEGG通路,GO分析包括三個子項,分別為生物過程(biological process)、細胞組成(cell component)以及分子功能(molecular function),見圖4。此外,使用Metascape數據庫進行KEGG信號通路分析,得到79條通路,排名前10通路,見圖5。

圖4 GO富集分析條形圖

圖5 KEGG富集氣泡圖

3.6 分子對接結果分析

選取Degree值排名前三的靶點蛋白作為配體,靶目標蛋白相匹配的活性成份做為化合物開展分子對接,其結合能(Binding energy)結果見表2,分子對接模擬見圖6。

圖6 分子對接模式圖

表2 銀杏葉活性成分與肝癌作用靶點的分子對接結果

4 討論

肝癌的發病機制可能與體重、年紀、自然環境、生活方式、基因遺傳等原因相關。中醫學的整體觀念將身體視作一個復雜系統,疾病是身體作用網絡的失調情況。中醫學治療著眼于復雜系統作用的總體調整,調節這一不平衡的網絡,使其修復到平衡狀態。因而,在中醫臨床實踐活動中,尋找治療肝癌的合理中藥,并分析其作用機制,才有較長遠的發展潛力[12]。

本實驗通過網絡藥理學方法及分子對接初步探討了銀杏葉抗肝癌的作用機制,篩選出銀杏葉抗肝癌的主要成分為木犀草素-4'-葡萄糖苷、毛莨黃素和芝麻素等10個關鍵化合物及10個關鍵靶點、10個相關信號通路,推斷出銀杏葉可能有抗肝癌的效果。根據GO和KEGG通路富集分析結果確定銀杏葉抗肝癌的重要作用通路,去除廣泛通路后,重點對“Estrogen signaling pathway”這一通路進行討論。

雌激素受體(estrogen receptor,ER)包括ERα和ERβ,在1977年首次發現于子宮內膜細胞,隨后,人們陸續在肝臟、乳腺、前列腺等器官中發現了ER的表達。ER是一類由配體激活的核轉錄因子,歸屬于核受體(nucleus receptor,NR)超家族成員,近些年,雌激素的基因組作用已獲得充足確認,對雌激素受體的非基因組作用的探究變成關注的聚焦點,尤其要注意激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋清絲氨酸、蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)數據信號通路、轉錄因子NF-κB與轉錄激活因子3(STAT3)數據信號通路[13]。

PI3K/AKT數據信號通路、雌激素與肝癌的發生發展趨勢PI3K/AKT數據信號通路被認為是腫瘤細胞存活的關鍵通路,被稱作“抗細胞凋亡通路”。由此可見,雌激素能一定程度抑制AKT磷酸化抑制肝癌細胞增殖,ER通路抑制STAT3活性來改變腫瘤的發展趨向,在非雌激素依賴的腫瘤中,炎癥因子的含量降低,危害腫瘤的自身免疫,進而形成腫瘤免疫的核心部分,ER通路抑制轉錄因子NF-κB發揮抗腫瘤功效,通過ER抑制NF-κB活化,既可以抑制下游增殖周期相關分子和基質金屬蛋白等腫瘤侵襲相關分子的表達[14],又可以下調抗凋亡基因Bcl-2,肝癌的發病率可以通過雌激素和其信號通路降低,進一步驗證雌激素具有抑制肝癌的分子機制。因而,在雌激素存有的情形下,PI3K/AKT信號通路、轉錄因子NF-κB與STAT3信號通路與肝癌的產生、發展趨勢和遷移息息相關,為進一步討論雌激素激活PI3K/AKT信號通路、轉錄因子NF-κB與STAT3信號通路在抗肝癌的作用機制奠定一定的理論基礎。

綜上所述,本研究運用網絡藥理學結合分子對接手段,從分子層面探討銀杏葉抗肝癌的作用機制,發現銀杏葉主要通過影響Estrogen signaling pathway信號通路抑制肝癌細胞,具有多成分、多靶點、多通路治療肝癌疾病的特點,為后續銀杏葉的開發研究提供理論基礎。