Numb調控ITGB1促進胃癌細胞對多柔比星敏感性的機制研究

陳勇 何冬雷 周江浩 梁月祥 楊丞

胃癌作為全球第四大常見惡性腫瘤和第三大癌癥相關死亡原因,手術是其唯一的根治性療法[1]。目前隨著手術技術的提高,早期胃癌患者5年生存率可達95%以上[2]。然而,胃癌患者的早期診斷率仍較低,意味著大多數患者在確診時已處于晚期,錯過了最佳手術期。晚期胃癌的主要治療方法是新輔助放化療、分子靶向治療和免疫治療相結合,化療與靶向治療的聯合使用明顯延長了晚期胃癌患者的總生存期和生活質量[3]。然而,胃癌細胞對化療藥物耐藥性的出現是臨床治療中的主要障礙,這可能導致預后不良。Numb是一種在哺乳動物組織中廣泛表達的進化上保守的蛋白質,具有多種功能,例如調控細胞不對稱自我更新、分裂、增殖、遷移以及其他信號通路[4]。研究表明,Numb可能在各種腫瘤類型中發揮抑癌作用,例如肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、乳腺癌等[5-8]。此外,已有研究表明,Numb在胃癌組織中表達水平下調,其可作為一種潛在的抑癌基因并用于胃癌診斷中[9]。但關于其是否對包括胃癌在內的惡性腫瘤細胞的化療敏感性產生影響筆者卻未見報道。鑒于此,本研究在檢測胃癌患者腫瘤組織內Numb表達變化的基礎上,進一步探究了Numb對化療藥物多柔比星(adriamycin,ADR)誘導胃癌細胞凋亡敏感性的影響以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胃癌細胞株SGC-7901(武漢華爾納生物科技有限公司),多柔比星(ADR)(美國Sigma公司),胎牛血清、胰酶、RPMI 1640培養液及Polybrene(美國Gibco公司),Trizol、cDNA第一鏈合成試劑盒及熒光定量檢測試劑盒(日本Takara公司),Hoechst 33342染液(上海鈺博生物科技有限公司),Annexin V/FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊生物公司),RIPA裂解液、NP40裂解液和ECL發光液(上海碧云天生物研究所),PVDF膜(美國Millipore公司),BCA蛋白測定試劑盒(上海翊圣有限公司),Protein A+G Agarose(上海聯邁生物公司),一抗抗體Numb、ITGB1、P-gp、PARP、Cleaved-caspase3及Cleaved-caspase9(英國Abcam公司),GAPDH抗體與二抗抗體辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。陰性對照慢病毒與Numb過表達慢病毒由上海吉瑪生物技術有限公司完成載體構建、包裝及滴度測定。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染:在SGC-7901細胞中添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液并培養于37℃、5%CO2恒溫箱內,常規傳代培養。將細胞按照2×104個/孔接種在96孔板上,過夜培養后,分別將陰性對照慢病毒、Numb過表達慢病毒感染至SGC-7901細胞,感染復數設為100,并添加Polybrene增強感染效果,12 h后,更換為新鮮配制的培養液培養,通過2 μg/ml嘌呤霉素進行篩選,獲得穩轉SGC-7901細胞株。

1.2.2 Hoechst 33258染色:將SGC-7901細胞隨機分為4組進行處理:①對照組:SGC-7901細胞正常培養;②ADR組:使用100 nmol/L ADR處理SGC-7901細胞;③pLVX-Numb組:將Numb過表達慢病毒感染至SGC-7901細胞;④pLVX-Numb+ADR組:將Numb過表達慢病毒感染至SGC-7901細胞,再用100 nmol/L ADR處理該細胞。48 h后收集上述4組細胞,常規消化、離心,PBS重懸清洗細胞,加入5 mg/L的Hoechst 33342染液,置于37℃條件下避光孵育30 min,PBS再次洗滌細胞,離心并重懸,取適量細胞混懸液制片,在熒光顯微鏡下觀察細胞結構改變情況。

1.2.3 流式細胞術:收集細胞后常規消化、離心,PBS清洗,使用1×binding buffer重懸,調節密度為1×106個/ml,吸取100 μl懸液置于流式檢測管中,在管內加入5 μl Annexin V/FITC與10 μl碘化丙錠,震蕩混勻,室溫孵育10 min,立即通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.4 Western blot法:在細胞中加RIPA裂解液提取上清,即獲得蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取等量40 μg蛋白經過10%SDS-PAGE電泳分離,電轉至PVDF膜,浸入5%脫脂奶粉封閉2 h。滴加稀釋的一抗,4℃孵育過夜。次日,TBST洗膜,將膜與HRP 標記的二抗在室溫下共孵育1 h,TBST再次洗膜,ECL顯影、曝光,Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白質灰度值,選擇GAPDH抗體作為內參蛋白,以目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應:Trizol法提取細胞的總RNA,NanoDrop2000系統測定RNA濃度與純度。去除RNA中的gDNA后,參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作合成cDNA,保存于-20℃條件下。qRT-PCR實驗根據熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)說明書步驟進行,以cDNA為模板,配制擴增反應體系,在Bio-CFX96系統上測定,實驗重復3次。結果根據2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量,以內參基因GAPDH對表達水平進行歸一化處理。

1.2.6 免疫共沉淀實驗:在細胞中加入NP40裂解液冰上裂解30 min,置于離心機上以12 000 r/min低溫離心20 min,吸取上清,移入干凈離心管內,加入Protein A+G Agarose,4℃條件下封閉2 h,排除非特異性結合蛋白。以12 000 r/min低溫離心10 min,吸取上清,加入ITGB1一抗抗體,IgG中加入等量同源IgG抗體,4℃條件下孵育過夜。次日,加入Protein A+G Agarose,4℃條件下繼續孵育4 h,以捕捉抗原-抗體復合物。再以12 000 r/min低溫離心10 min,棄去上清并保留沉淀,添加NP40蛋白洗脫液后離心,重復洗脫一次,加入上樣緩沖液,混勻,將蛋白加熱煮沸變性,通過Western blot實驗進行檢測。

2 結果

2.1 Numb對多柔比星處理下胃癌細胞凋亡的影響

2.1.1 熒光顯微鏡下觀察:對照組的SGC-7901細胞胞核外圍輪廓較為清晰,并且形態、大小一致,無明顯核濃縮現象;ADR組和pLVX-Numb組細胞出現較多濃縮、碎裂的藍色凋亡體,說明細胞凋亡數目較多;pLVX-Numb+ADR組中核濃縮與碎裂的細胞較pLVX-Numb組進一步增加,說明該組細胞凋亡數目更多。見圖1。

圖1 4組SGC-7901細胞凋亡形態觀察(Hoechst 33258染色×100)

2.1.2 與對照組比較,ADR組和pLVX-Numb組的細胞凋亡率均顯著增加(P<0.05);與ADR組比較,pLVX-Numb+ADR組細胞凋亡率則又顯著增加(P<0.05)。見圖2,表1。

表1 4組SGC-7901細胞凋亡率比較 %,

圖2 4組SGC-7901細胞凋亡率比較

2.2 Numb對多柔比星處理下胃癌細胞耐藥蛋白與凋亡相關蛋白的表達影響 與對照組比較,ADR組和pLVX-Numb組細胞內P-gp和PARP蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05),Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9蛋白相對表達量均顯著上調(P<0.05);pLVX-Numb+ADR組細胞P-gp和PARP蛋白相對表達量又顯著低于ADR組(P<0.05),Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9蛋白相對表達量均顯著高于ADR組(P<0.05)。見圖3,表2。

表2 4組SGC-7901細胞中P-gp、PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達比較

圖3 4組SGC-7901細胞中P-gp、PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白條帶

2.3 Numb1在蛋白翻譯后水平上調控ITGB1的表達 對照組、pLVX-NC組及pLVX-Numb組的SGC-7901細胞中ITGB1 mRNA相對表達量間無統計學差異(P>0.05)。但pLVX-Numb組的SGC-7901細胞中ITGB1 蛋白相對表達量顯著低于對照組和pLVX-NC組的細胞中ITGB1 蛋白相對表達量(P<0.05)。SGC-7901細胞中內源性Numb與內源性ITGB1能夠形成復合物,發生免疫共沉淀;與對照組比較,pLVX-Numb組細胞中ITGB1蛋白泛素鏈明顯增強,說明過表達Numb增加了ITGB1的泛素化水平。見表3,圖4、5。

表3 3組SGC-7901細胞中ITGB1 mRNA與蛋白表達比較

圖4 3組SGC-7901細胞中ITGB1蛋白條帶

3 討論

Numb定位于極化上皮細胞的基底層,介導細胞膜蛋白的內吞作用和內吞轉運,并涉及細胞多種生物學過程。越來越多的研究揭示了Numb與癌癥發展之間的關聯,在各種癌癥類型中Numb表達降低甚至缺失,且這一現象與促進腫瘤生長、侵襲、轉移和干性維持等密切相關[10,11]。

已有研究表明,SRPK2通過負調控Numb和p53在結直腸癌中促進細胞遷移和侵襲,并降低結直腸癌細胞對吉西他濱或奧沙利鉑治療的化學敏感性[12],這一結果提示,Numb表達下調可能與化療敏感性降低也相關。本研究結果顯示,在胃癌細胞中提高Numb表達可增強ADR處理下的細胞增殖抑制率,并促進ADR誘導的細胞凋亡,抑制細胞內P-gp和PARP蛋白表達并促進Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9蛋白表達。

P-gp作為由多藥耐藥基因編碼的高分子量糖蛋白,其過表達是產生耐藥的重要原因之一,P-gp進入腫瘤細胞后與化療藥物分子結合,利用ATP水解產生的能量將藥物泵出細胞,從而降低細胞內藥物濃度,抑制腫瘤細胞的化療敏感性[13]。

PARP在DNA損傷后被激活,可結合到DNA斷裂部位,參與DNA雙鏈損傷修復,目前以PARP為靶點開發抑制劑來誘導腫瘤細胞凋亡已成為抗腫瘤的潛在治療策略[14]。化療藥物通過作用于腫瘤細胞內DNA、酶及蛋白等靶分子來誘導細胞凋亡,該作用依賴于Caspase途徑,因此,腫瘤細胞在化療過程中出現凋亡機制受阻亦可降低化療敏感性,Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9是影響細胞凋亡的關鍵蛋白酶,其切割水平可以反映細胞凋亡情況[15]。由此推測,Numb能夠促進ADR誘導的胃癌細胞凋亡,提高胃癌細胞對ADR的化療敏感性。

ITGB1是構成整合素的最大亞家族成員,是參與多種生理和病理生理過程的細胞表面受體,并且越來越多的證據表明,ITGB1在多種癌癥類型中有異常表達,并通過介導細胞遷移、侵襲、存活以及凋亡促進腫瘤的惡性表型[16,17]。此外,ITGB1還被發現介導腫瘤細胞對多種抗癌藥物的耐藥性產生,例如,ITGB1通過介導Cdc42 激活PI3K/p110β 信號傳導途徑促進胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性[18];另有證據表明抑制 ITGB1能夠增強西妥昔單抗對結直腸癌細胞增殖的抑制作用,提高結直腸癌細胞對西妥昔單抗的敏感性進而促進細胞凋亡[19]。

本研究發現ITGB1不僅在胃癌組織內高表達,且在胃癌細胞中提高Numb表達后抑制了ITGB1表達,進一步發現細胞內源性Numb與ITGB1能夠形成復合物,此外,過表達Numb增加了ITGB1的泛素化水平而降低ITGB1蛋白表達水平。該結果提示,Numb提高胃癌細胞對ADR敏感性的作用可能與其介導調控ITGB1蛋白表達相關。

綜上所述,本研究證實Numb能夠增強ADR對胃癌細胞增殖的抑制作用,促進ADR誘導的胃癌細胞凋亡,從而提高了胃癌細胞對ADR敏感性,且Numb可以調控ITGB1蛋白表達水平,這可能與其發揮的作用相關。本實驗為提高胃癌化療敏感性的臨床治療提供了一個新靶點。