中草藥復(fù)方制劑對(duì)烏鱧諾卡氏菌病藥效研究

朱宇嘉，朱盛山

（廣州市普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

烏鱧（Channa argus）是我國主要養(yǎng)殖品種之一，根據(jù)《2021 中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，我國2020 年烏鱧養(yǎng)殖年產(chǎn)量已達(dá)50 萬t，產(chǎn)量年增幅10%。近年來，諾卡氏菌病頻發(fā)，成為烏鱧養(yǎng)殖成功率不斷下降的主要因素之一。諾卡氏菌病在烏鱧育苗及成魚養(yǎng)殖階段均有發(fā)生，每年4—11 月為高發(fā)期，發(fā)病率可達(dá)60%，死亡率可達(dá)80%，嚴(yán)重威脅烏鱧的健康養(yǎng)殖。導(dǎo)致諾卡氏菌病的主要菌種包括諾卡氏菌、星諾卡氏菌和殺鮭諾卡氏菌，其中諾卡氏菌是較為普遍的一種[1-2]。被諾卡氏菌病感染后，產(chǎn)生的主要癥狀包括：厭食、游泳遲緩、鰭部出血、白色結(jié)節(jié)（肉芽腫）、體表（包括鰓部、皮下等）潰瘍出血（俗稱爛身）等[2-10]。

Wang 等[3]通過注射熒光標(biāo)記的諾卡氏菌感染四帶無須魮（Puntius tetrazona），發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可隨血液循環(huán)擴(kuò)散到心、肝、腎等組織，引起吞噬細(xì)胞聚集、死亡，進(jìn)而形成肉芽腫即俗稱白色結(jié)節(jié)。Maekawa等[11]研究發(fā)現(xiàn)，諾卡氏菌感染形成肉芽腫后，在肉芽腫中心出現(xiàn)壞死以及細(xì)菌（諾卡氏菌）聚集，一般用藥難以進(jìn)入肉芽腫內(nèi)部。夏立群等[12]在諾卡氏菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)動(dòng)力蛋白調(diào)節(jié)蛋白robl/LC7，凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，諾卡氏菌robl/LC7 可能參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，這有利于其在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存及免疫逃避。諾卡氏菌感染產(chǎn)生的結(jié)節(jié)以及其自身具備的免疫逃避等特點(diǎn)，導(dǎo)致諾卡氏菌病難以治療。養(yǎng)殖中，常用混合抗生素治療，但效果甚微[10]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）在報(bào)告中指出，抗生素難以防治諾卡氏菌病[13]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)烏鱧來源于中山市容海水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。體質(zhì)量為（205±10）g，諾卡氏菌及其他試劑信息見表1。

表1 試驗(yàn)使用材料信息①

1.2 儀器

試驗(yàn)使用的儀器及相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 試驗(yàn)使用儀器信息

1.3 菌種復(fù)蘇與菌液制備

從超低溫冰箱中取出凍存的諾卡氏菌株，使用經(jīng)火焰消毒后的接種環(huán)，挑取少量諾卡氏菌于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃振搖培養(yǎng)7 d。以空白腦心浸液肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照液調(diào)零，在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定菌懸液吸光值（OD），計(jì)算含菌數(shù)，并稀釋成1×109cfu/mL 的菌懸液。

1.4 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定試驗(yàn)

采用2 倍稀釋平皿培養(yǎng)法測(cè)定MIC[14]。將受試HNK、穿梅三黃散、大黃流浸膏，用適宜溶劑配制成1 g/mL 的藥液，高壓滅菌后，按2 倍遞減濃度稀釋，共配制成11 個(gè)濃度梯度（250.00，125.00，62.50，31.30，15 .60，7.80，3.00，1.90，0.98，0.49 和0.24 g/L）的藥物稀釋液。按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μL，于96 孔板第1~11 孔中，第12 孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μL，作陰性對(duì)照，置恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d。肉眼觀察，無菌生長(zhǎng)的最低濃度為該試菌的MIC。

1.5 藥效試驗(yàn)

1.5.1 攻毒試驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)置5 個(gè)感染組（其諾卡氏菌株菌液濃度分別為2×105，2×106，2×107，2×108和2×109cfu/mL），1 個(gè)空白對(duì)照組。每組放養(yǎng)烏鱧20 尾，于1 m3水族箱中暫養(yǎng)1 周后開始攻毒試驗(yàn)。感染組按對(duì)應(yīng)菌液濃度，在烏鱧腹腔注射，劑量為0.5 mL/尾，對(duì)照組注射0.5 mL 生理鹽水。攻毒后，繼續(xù)飼養(yǎng)14 d，暫養(yǎng)和試驗(yàn)期間，飼料投喂量為烏鱧體質(zhì)量的3%，觀察烏鱧的行為、癥狀和死亡率。采用文獻(xiàn)[7]的評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選攻毒后死亡率最高且存活時(shí)間較長(zhǎng)的菌液濃度ρg，作為后續(xù)試驗(yàn)攻毒菌液濃度。

1.5.2 治療試驗(yàn)

試驗(yàn)按治療方式共設(shè)置6 組，分別標(biāo)記為HNK高劑量組、HNK 中劑量組、HNK 低劑量組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組放養(yǎng)烏鱧20 尾，于1 m3水族箱中暫養(yǎng)1 周后開始治療試驗(yàn)。6 組烏鱧均經(jīng)腹腔注射0.5 mL 濃度為ρg的諾卡氏菌液，攻毒6 h 后，開始治療。其中用HNK 治療的3 組，HNK 劑量分別為2.0，0.7 和0.2 g/kg，給藥方式均為拌料給藥，連續(xù)給藥4 d。陽性對(duì)照組采用氨芐西林[10]治療，給藥劑量為0.25 mg/kg，給藥方式均為拌料給藥，連續(xù)給藥7 d。陰性對(duì)照組攻毒不給藥，空白對(duì)照組不攻毒、不給藥。6 組烏鱧均每天投喂1 次，投喂量均為其體質(zhì)量的3%。給藥后飼養(yǎng)14 d，記錄魚行為、癥狀變化以及死亡量。采用癥狀減幅，描述用藥后某癥狀減少幅度，計(jì)算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

2.2 烏鱧感染諾卡氏菌后的癥狀

攻毒后，烏鱧出現(xiàn)游泳遲緩、食欲下降現(xiàn)象，部分魚出現(xiàn)吞食后吐出。病魚體出現(xiàn)散點(diǎn)狀出血，肛門、魚鰭根部發(fā)紅，鰓部充血。解剖觀察，病魚腎臟腫大或呈不規(guī)則隆起，肝臟、腎臟有乳白色結(jié)節(jié)。烏鱧感染諾卡氏菌后癥狀見圖1（a）（b）（c）。各攻毒組出現(xiàn)典型癥狀尾數(shù)見表3。

圖1 烏鱧感染諾卡氏菌后癥狀

表3 各攻毒組出現(xiàn)典型癥狀尾數(shù)

2.3 不同劑量諾卡氏菌對(duì)烏鱧死亡率影響

不同攻毒劑量對(duì)烏鱧死亡率的影響見圖2。由圖2 可見，對(duì)照組（注射生理鹽水組）共計(jì)死亡1 尾，死亡率5%。各攻毒組在1~6 d 未出現(xiàn)死亡，從7 d 開始死亡率逐步上升，各感染組（2×105，2×106，2×107，2×108和2×109cfu/mL）14 d 累計(jì)死亡率分別為10%，25%，80%，100%和100%，攻毒組死亡率高于對(duì)照組（0 cfu/mL）。

圖2 不同攻毒劑量對(duì)烏鱧死亡率的影響

此外，烏鱧死亡率與攻毒菌液濃度成正相關(guān)。2×108和2×109cfu/mL 感染組14 d 內(nèi)死亡率均為100%，但2×109cfu/mL 感染組在第12 d 全部死亡，而2×108cfu/mL 感染組在第14 d 全部死亡。

2.4 HNK 對(duì)烏鱧諾卡氏菌病治療效果

圖3 不同劑量HNK 對(duì)烏鱧諾卡氏菌病治療效果

表4 攻毒試驗(yàn)各治療組出現(xiàn)典型諾卡氏菌病癥狀魚數(shù)量 尾

表5 用藥組典型癥狀減幅 %

3 討論

3.1 烏鱧感染諾卡氏菌的癥狀及死亡率

文獻(xiàn)[8，15]攻毒試驗(yàn)中，1~6 d 各組均未發(fā)現(xiàn)死亡病例，這可能是因?yàn)橹Z卡氏菌生長(zhǎng)慢，病程長(zhǎng)，感染后不會(huì)立刻出現(xiàn)死亡，此結(jié)果與本攻毒試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 HNK 對(duì)諾卡氏菌的抑制效果

本治療試驗(yàn)中，HNK 高、中劑量組死亡率相比陰性對(duì)照組有明顯下降，且優(yōu)于陽性對(duì)照組（抗生素組）。可見HNK 能夠有效提高諾卡氏菌感染后病魚的存活率。癥狀減幅結(jié)果顯示，HNK 高、中劑量組結(jié)果相近，但均明顯優(yōu)于陽性對(duì)照組與HNK 低劑量組。HNK 高、中劑量組內(nèi)臟結(jié)節(jié)與體表潰瘍癥狀減幅較腎臟腫大，這可能是因?yàn)槟I臟腫大是諾卡氏菌病早期癥狀，注射攻毒后，在較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生，HNK 用藥后，用藥后能夠抑殺病原菌，阻斷其在體內(nèi)擴(kuò)散，感染后期的體表潰瘍及內(nèi)臟結(jié)節(jié)等病重癥狀減少。

綜合HNK 體外抑菌效果以及治療試驗(yàn)，認(rèn)為HNK 高、中劑量給藥，能夠有效防控諾卡氏菌感染引起的相關(guān)疾病，且效果優(yōu)于受試抗生素（氨芐西林）。

3.3 諾卡氏菌感染途徑與防控方案

本試驗(yàn)中，攻毒試驗(yàn)采用腹腔注射進(jìn)行人工感染，對(duì)比口服、浸泡、創(chuàng)傷浸泡發(fā)現(xiàn)，其感染率明顯低于腹腔注射，口服和浸泡感染基本無效[7]。文獻(xiàn)[15，17]的研究結(jié)果也類似。因此認(rèn)為，在實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境中，諾卡氏菌經(jīng)口腔感染的可能性較低。此外，本攻毒試驗(yàn)中，烏鱧感染諾卡氏菌后，其體表潰瘍出現(xiàn)頻率低，潰瘍部位面積小，未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖中常見的鰓部、皮下結(jié)節(jié)癥狀。由此可見，感染途徑不同，出現(xiàn)癥狀亦不同。在養(yǎng)殖中，諾卡氏菌最可能的感染途徑是經(jīng)體表創(chuàng)傷處感染。因此，建議養(yǎng)殖業(yè)者在養(yǎng)殖對(duì)象出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)、魚體擦傷或因寄生蟲啃噬產(chǎn)生傷口后，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行細(xì)菌病害預(yù)防，避免感染和擴(kuò)散。