甘蔗根系土壤浸提液GC-MS檢測預處理工藝優化

王士龍,朱景煥,孫曉波,賓彩艷

(廣西科技師范學院,廣西來賓 546199)

甘蔗(Saccharumofficinarum),甘蔗屬,多年生高大實心草本,屬C4作物,為喜溫、喜光作物,廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區。土壤是甘蔗生產的基礎,根系土壤中存在的物質與甘蔗產量和質量的形成密切相關。由于耕地面積有限,甘蔗種植單一連作現象比較普遍,連作障礙是常見問題,根際土壤中化感物質積累是引起連作障礙的主要原因之一[1]。張愛加等[2]研究表明,甘蔗幼苗期宿根根際土壤甲醇浸提液中與化感作用相關的物質主要有5大類54個,這些物質的積累抑制了宿根甘蔗的生長,同時也破壞了根際微生態,使得病原菌富集、土壤營養元素循環受阻,從而影響了甘蔗的產量和質量。李賢宇[3]研究也表明,宿根甘蔗根際土壤中積累的化感物質較多。

化感物質是植物分泌的次生代謝產物或植物凋落物的分解產物[4]。植物釋放化感物質的途徑大體上分為雨霧淋溶、自然揮發、殘體分解和根系分泌4種,Rice等[5-11]將化感物質分為14種,有酚類、萜類、黃酮類、有機酸、脂族醛和酮等?；形镔|具有選擇性和專一性、復合效應和構效關系,其中的構效關系是指化感物質的性能很大程度上取決于化感物質的分子結構,進而決定其化感作用的性質和強度[12]。錢敏[13]利用化感物質的生物活性,合成了兩大類共64個結構新穎的芳氧乙酰氧基異黃酮衍生物和芳氧乙酰氧基查爾酮衍生物,這兩大類目標化感物質均表現出較高的除草活性。另外,化感物質也可開發成殺蟲劑[14]?；形镔|鑒定需要先對樣品進行預處理,因此需要對甘蔗根系土壤中化感物質提取工藝進行優化。

有研究表明,植物地上部和土壤中的化感物質可以用溶劑提取法提取[15]。常用的有機浸提溶劑有甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等[15-21]。劉賢文等[1]研究馬鈴薯、玉米土壤中化感物質時采用甲醇溶劑輔助超聲波處理,陳冬梅等[22]對連作煙草根際土壤化感物質提取和鑒定采用甲醇溶劑浸提,宋宇加[23]對人參根際土壤中化感物質的分離和鑒定采用甲醇提取。該試驗采用甲醇試劑浸提并輔助超聲波預處理方法,以質譜數據庫檢索出的化感物質種類數量為評價指標,并通過單因素和正交試驗對預處理工藝條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1儀器。電子天平(上海越平科學儀器公司,FA2004);鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械公司,GZX-GF101-3BS);箱式電阻爐(上海躍進醫療器械公司,SX2-5-12);數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司,KQ-300DB);臺式高速離心機(湖南湘儀公司,H1850);漩渦混合器(上海醫大儀器公司,XW-80A);旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠,RE-52AA);氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent,7890B/5977A GCMSD)。

1.1.2試劑。甲醇(色譜純);MgSO4(分析純),在使用MgSO4前用馬弗爐以500 ℃烘6 h,180 ℃取出,置于干燥器內冷卻備用。

1.2 GC-MS條件

1.2.1氣相色譜條件。色譜柱為HP-5MS UI(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進口溫度220 ℃,載氣為氦(He),流量1 mL/min,進樣量1 μL。氣相色譜程序升溫條件如表1所示,總運行時間41.33 min。

表1 氣相色譜程序升溫條件

1.2.2質譜條件。電離方式為EI;電子能量70 eV;阱溫200 ℃,阱外套溫度50 ℃,傳輸線溫度280 ℃;掃描范圍50～1 000 amu。應用計算機檢索系統NIST MS將質譜數據與數據庫進行匹配確定化感物質。

1.3 試驗方法

1.3.1預處理方法。稱取烘干的甘蔗根系土壤4.00 g(精確至0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入甲醇(色譜純)進行超聲波處理,超聲波處理后取上清液于圓底燒瓶中,用旋轉蒸發儀進行蒸發濃縮,濃縮后用甲醇溶解并定容至10 mL具塞刻度試管中,將定容后的樣液倒入50 mL具塞離心管中并加入0.5 g無水硫酸鎂,混合2 min,再置于離心機進行離心,4 000 r/min條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm有機針式濾膜后轉移至進樣瓶中,等待上機測定。

1.3.2單因素試驗。

1.3.2.1料液比對檢出化感物質種類數量的影響。分別加入16、20、24、28、32 mL甲醇溶劑進行超聲波處理,即料液比為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8(g∶mL),超聲時間為60 min,超聲功率為210 W,檢測化感物質種類數量,找出最佳料液比。

1.3.2.2超聲波功率對檢出化感物質種類數量的影響。采用試驗中確定的最佳料液比,在超聲波處理時選擇150、180、210、240、270 W不同超聲波功率處理樣品,檢測化感物質種類數量,找出最佳超聲波功率。

1.3.2.3超聲波時間對檢出化感物質種類數量的影響。采用試驗中確定的最佳料液比和最佳超聲波功率,在超聲波處理時選擇20、40、60、80、100 min不同超聲波時間處理樣品,檢測化感物質種類數量,找出最佳超聲波時間。

1.3.3正交試驗。根據單因素試驗結果,各取3個水平,以檢測出的化感物質種類數量為指標,采用L9(34)正交表進行正交試驗設計,正交試驗因素水平如表2所示。

表2 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1料液比對檢出化感物質種類數量的影響。如圖1所示,經GC-MS測試,1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8不同料液比處理后樣品所檢測出的化感物質種類數量分別為12、14、13、12、11個。其中2,5-二叔丁基酚是5個處理中都檢測出的化感物質,5個料液比中1∶5 處理時檢測出的化感物質種類最多。當料液比低于1∶5 時檢測出的化感物質逐漸減少,原因是甲醇量增大會使化學物質溶出增加,有些化學成分相互間發生反應生成其他物質,導致檢測出的化感物質數量減少。因此,選擇1∶5為最佳料液比。

圖1 料液比對檢測出的化感物質種類數量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the quantity of allelochemicals detected

2.1.2超聲波功率對檢出化感物質種類數量的影響。如圖2所示,經GC-MS測試,150、180、210、240、270 W不同超聲波功率處理后樣品所檢測出的化感物質種類數量分別為11、13、15、12、11個。其中棕櫚酸甲酯是經5個不同超聲波功率處理后都檢測出的化感物質。超聲波功率為210 W處理時檢測出的化感物質種類數量最多,當超聲波功率高于210 W時檢測出的化感物質逐漸減少,原因可能是超聲波功率過高產生的空化效應過大,導致部分化學物質降解。因此,選擇210 W為最佳超聲波功率。

圖2 超聲波功率對檢測出的化感物質種類數量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the quantity of allelochemicals detected

2.1.3超聲波時間對檢出化感物質種類數量的影響。如圖3所示,經GC-MS測試,20、40、60、80、100 min不同超聲波時間處理后樣品所檢測出的化感物質種類數量分別為11、13、14、16、16個。其中十一烷、2,5-二叔丁基酚、棕櫚酸甲酯是5個不同超聲波時間處理后都檢測出的化感物質,超聲波時間為80和100 min處理時檢測出的化感物質種類數量最多。隨著超聲波時間的延長檢測出的化感物質種類數量增加,可能是因為超聲波時間延長會是使化學物質溶出更充分。因此,選擇80 min為最佳超聲波時間。

圖3 超聲波時間對檢測出的化感物質種類數量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the quantity of allelochemicals detected

2.2 正交優化試驗由表3可知,3個因素對甘蔗根系土壤中化感物質種類數量的影響由大到小依次為B>C>A,即超聲波功率>超聲波時間>料液比,各因素水平的最優組合為A2B2C3,該組合與正交試驗5相同,即最優預處理條件是料液比1∶5、超聲波功率210 W、超聲波時間100 min。最優預處理條件檢測出的化感物質如表4所示,共檢測出化感物質種類為17個。

表3 正交試驗結果

表4 最優預處理條件檢測出的化感物質

1,3,5,6,7-pentamethylbicyclo[3.2.0]hepta-2,6-diene、2,5-二叔丁基酚、棕櫚酸甲酯3種物質是9個正交試驗設計中檢測出的共有化感物質。棕櫚酸甲酯可作為一種有開發潛力的植物殺螨劑[24],也可制備具有農藥增效功能的助劑組合物;棕櫚酸可以作為合成番茄紅素的碳源,也可抑制病原真菌和線蟲的繁殖,有效改善土壤環境[25]。

3 結論與討論

為浸提出甘蔗根系土壤中的化感物質,采用甲醇浸提并輔助超聲波預處理方法,通過單因素和正交試驗對預處理工藝條件進行優化。結果表明,預處理的最優條件為料液比1∶5(g∶mL)、超聲波功率210 W、超聲波時間100 min,檢測出來的化感物質有17個。從最優的預處理工藝檢測出的化感物質種類數量還比較少,原因可能是在自然條件下,土壤中的非生物和生物等因素會發生遷移、化學轉化和生物降解,可形成聚合物或降解成小分子物質,會對檢測出的化感物質種類數量產生影響[26]。因此采集根際土壤樣品應按照技術標準操作,并及時對樣品進行預處理和上機檢測。