河南新野產(chǎn)紫甘藍(lán)花青素的提取工藝和調(diào)節(jié)雙卵巢切除模型(OVX)小鼠糖耐量的研究

周自亮,張藝菁,何 葉,周少金,張亞麗,詹艷柯,曹紅衛(wèi), 張仲鳴,*

(1.河南省淅川縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,河南淅川 474450;2.河南省張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院,河南南陽(yáng) 473004;3.河北邯鄲天道酒業(yè)有限公司,河北邯鄲 056000)

花青素是植物體內(nèi)的水溶性色素,由黃酮類(lèi)前體經(jīng)過(guò)苯丙素途徑衍生而成。花青素主要存在于植物細(xì)胞的液泡中,因?qū)H、光線、溫度和金屬離子等敏感而呈現(xiàn)紅色、紫色或黑色等不同顏色[1-3],是植物體多彩的重要原因之一。花青素多見(jiàn)于植物的花器官,如杭白菊(Chrysanthemummorifolium)[4]和蝶豆(Clitoriaternatea)[5-6]的花瓣,或果實(shí)或果皮中,如越桔(VacciniumsectionCyanococcus)[7]、藍(lán)莓(VacciniumAngustifolium)[8]、葡萄(Vitisvinifera)[9]和南陽(yáng)綠米(OryzasativaL.Nanyangensis)的稻殼中[10],也可存在于植物的營(yíng)養(yǎng)器官中,如紫薯(Dioscoreaalata)[11]、甜菜根(Betavulgaris)[9]和紫甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitatarubra)[12]等,這些植物的組織和器官形成了花青素的自然資源。

花青素被認(rèn)識(shí)有超過(guò)100年的歷史,但真正深入認(rèn)識(shí)是1990年后,尤其在2015年后,相關(guān)研究為花青素用于人類(lèi)慢性病的預(yù)防和治療取得了較大的進(jìn)展[13]。花青素是黃酮類(lèi)化合物中反應(yīng)力較強(qiáng)的一類(lèi),其抗自由基氧化能力是維生素E的50倍,維生素C的20倍[14]。同時(shí),具有抗炎癥、抗過(guò)敏、改善腸道菌群等綜合效果[2,8,13,15- 16],飲食中含花青素的水果或蔬菜可降低餐后血糖水平,提高降血糖反應(yīng)時(shí)間[17],直接服用花青素可減少心血管疾病和 Ⅱ 型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病概率[18],防止肥胖[15],對(duì)高糖誘導(dǎo)的高膽固醇和炎癥[15,19]、心血管疾病[15-16,20]、關(guān)節(jié)炎[21]等慢性疾病有防治效果;也可延遲神經(jīng)衰老[2,8]和抗抑郁[22],對(duì)退行性疾病和精神病具有明顯的改善作用。花青素還可以改善卵巢切除小鼠模型的血液膽固醇水平[23]。花青素也作為化妝品[24-25]、食品[3,26]、飼料[27-28]、酒和普通飲品的添加劑[29],是提高食品品質(zhì)的重要手段。由于花青素的顏色隨酸堿度變化而呈現(xiàn)不同的顏色,因此也作為顯示酸堿度變化(即新鮮度)的牛奶、肉類(lèi)和魚(yú)制品的食物智能包裝膜[30]。另外,分子模型的模擬研究表明,花青素還可能通過(guò)結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)抑制新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞,并抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNFα)、白細(xì)胞介素6(IL6)的升高,提高抗炎癥因子如白細(xì)胞介素10(IL10)的水平,從而減輕新冠病毒感染后的癥狀[5]。鑒于對(duì)花青素認(rèn)識(shí)的深入和食物、藥物及化妝品市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大,花青素的需求量持續(xù)穩(wěn)步提高,根據(jù)2021年最新出版的國(guó)際花青素市場(chǎng)(Anthocyanins Market)年度報(bào)告預(yù)估,2022—2027年國(guó)際花青素市場(chǎng)將以平均4.5%的速度增長(zhǎng),其中,亞太地區(qū)的增長(zhǎng)率最為強(qiáng)勢(shì)。因此,尋求高質(zhì)量、相對(duì)低成本和供給穩(wěn)定的花青素資源將是一項(xiàng)亟待解決的工作。

紫甘藍(lán)(B.oleraceavar.capitatarubra)屬十字花科植物,又稱(chēng)紫苞菜,起源于歐洲[16],因其花青素合成過(guò)程中的抑制基因BoMYBL2-1表達(dá)缺失而導(dǎo)致葉表皮細(xì)胞富含花青素而顯示紅紫色[31]。變異后的紫甘藍(lán)也被稱(chēng)為“西土藍(lán)”,可用于治感冒、發(fā)燒口渴、支氣管炎、咳嗽、食積、便秘、小便不利等疾病。紫甘藍(lán)因富含花青素而具有抗氧化、抗微生物感染、抗癌[12]和緩解 Ⅱ 型糖尿病[18]等功能,是典型的功能食品。紫甘藍(lán)現(xiàn)在世界各地都有種植,近年來(lái)在河南新野縣也大量種植,完善的栽培工藝已經(jīng)可以達(dá)到四季均可產(chǎn)出,產(chǎn)量可達(dá)75 000 kg/hm2,具有易種、易采、產(chǎn)量大的特點(diǎn)。因此,紫甘藍(lán)的高產(chǎn)量是其他蔬菜和水果不具備的,紫甘藍(lán)花青素具有價(jià)廉和資源穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),也因此引起了廣泛的關(guān)注[16]。

目前對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取工藝的研究主要集中于單個(gè)因素如溫度、溶劑濃度、提取時(shí)間或溫度等以及提取手段如溶劑類(lèi)型、超聲波和臨界冷凍萃取等對(duì)提取量和產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響[8]。但對(duì)單個(gè)因素的系統(tǒng)研究和多因子綜合作用的效果鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究利用不同波長(zhǎng)下光密度差異法和Greey公式測(cè)定新野產(chǎn)紫甘藍(lán)中花青素的含量,研究溫度、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度等單個(gè)因素對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響,在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn),得到最佳提取條件和相應(yīng)的花青素提取量;同時(shí),采用手術(shù)摘除小鼠雙側(cè)卵巢(OVX)誘導(dǎo)糖耐量降低的動(dòng)物模型,研究紫甘藍(lán)花青素對(duì)更年期動(dòng)物模型糖耐量的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。紫甘藍(lán)采自南陽(yáng)新野縣種植的新鮮紫甘藍(lán),收集的時(shí)間為2020年和2021年3—6月。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用的雌性昆明小鼠購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,鼠齡8周,體重(23±2)g。動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中光照模仿12 h∶12 h晝夜模式(06:00—18:00),恒溫(22.0±0.5)℃,相對(duì)濕度約40%。試驗(yàn)操作和動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范按照南陽(yáng)理工學(xué)院相關(guān)文件(NITAEE17-0014)要求和動(dòng)物學(xué)會(huì)相關(guān)要求進(jìn)行[32]。

1.1.2主要儀器。島津紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理有限公司);定量PCR所用儀器為ViiA 7 (Thermal Fisher Scientific,Waltham,MA,USA);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義子華儀器有限公司);真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);穩(wěn)豪倍易型血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司);血糖試紙[穩(wěn)捷(歐洲)公司]。

1.1.3試劑。Trizol試劑購(gòu)自Ambion (Carlsbad,CA,USA);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermal Scientific (Waltham,MA,USA);G6Pase和β-actin 引物購(gòu)自Synbio Technologies (Suzhou,China);定量PCR 5× Master Mix 購(gòu)自abm Inc (Richmond,BC.Canada);瓊脂糖粉購(gòu)自Gene company Ltd.(Spain);TAE電泳緩沖液購(gòu)自Solarbio (北京)。補(bǔ)佳樂(lè)為戊酸雌二醇片,購(gòu)自DELPHARM Lille S.A.S.(法國(guó))。乙醇、鹽酸均為分析純,分別購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司和洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4引物。定量PCR所用的葡萄糖-6-磷酸酶引物分別為正向引物GCTGGAGTCTTGTCAGGCAT、負(fù)向引物ATCCAAGCGCGAAACCAAAC(accession # NM_008061.4);采用的對(duì)照基因?yàn)棣?Actin,引物分別為正向引物CGGGACCCTGACTATGGGA、負(fù)向引物GCACTTGCTGAAGTATCGATGG(accession # NM_007393.2)[32]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1紫甘藍(lán)花青素提取的單因素試驗(yàn)。單因素對(duì)花青素提取影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)主要參考孫美玲等[10]的研究,工藝過(guò)程為新鮮紫甘藍(lán)葉切碎→加入酸化乙醇水溶液→水浴加熱提取3次(每次2 h)→合并提取液,離心→定容至25 mL→定量分析。

1.2.2紫甘藍(lán)中花青素含量測(cè)定方法和花青素制備。紫甘藍(lán)中花青素含量的測(cè)定方法主要參照孫美玲等[10]的研究。簡(jiǎn)言之,首先利用酸性乙醇提取液確定紫甘藍(lán)水提液的最大吸收峰波長(zhǎng)為530 nm,說(shuō)明提取液中的主要物質(zhì)是花青素。利用島津紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)分別測(cè)定提取液在530 nm、620 nm(可溶性糖)、650 nm(葉綠素)波長(zhǎng)下的光密度,利用Greey公式計(jì)算花青素的光密度:

ODλ=(OD530-OD620)-0.1×(OD650-OD620)

并根據(jù)下列公式,由OD值計(jì)算出溶液中的花青素含量:

其中:ODλ為530 nm波長(zhǎng)下花青素的光密度;ε為花青素的摩爾消光系數(shù)4.62×104;V為提取液總體積(mL);m為取樣質(zhì)量(g)。

所提取的花青素經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑中的乙醇,低溫冷凍干燥濃縮約為1 g/L濃度用于動(dòng)物試驗(yàn)。

1.2.3紫甘藍(lán)中花青素提取最佳工藝的確定。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn),從中得出最佳提取工藝。每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù),取平均值。正交試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.4OVX小鼠模型的建立及紫甘藍(lán)水提液對(duì)OVX小鼠糖耐量的調(diào)節(jié)作用。選取60 d健康昆明小鼠48只,經(jīng)適應(yīng)培養(yǎng)7 d后,分為5組,分別為假手術(shù)對(duì)照(Shm+H2O)、OVX手術(shù)+水(OVX+H2O)、OVX手術(shù)+普通甘藍(lán)水提液(OVX+BO)、OVX+100 mg/(kg·d)紫甘藍(lán)花青素(灌胃體積0.5 mL)(OVX+BOR)、OVX+0.02 mg/(kg·d)補(bǔ)佳樂(lè)(OVX+E2)。花青素的用量參照Fang等[22]的研究結(jié)果。動(dòng)物用水合氯醛麻醉(4%,0.2 mL/20 g)后進(jìn)行OVX手術(shù),7 d后,待動(dòng)物體重恢復(fù)到手術(shù)前水平,開(kāi)始上述分組處理;每只小鼠每天灌胃體積不超過(guò)0.5 mL,持續(xù)70 d后,小鼠經(jīng)饑餓12 h,取尾靜脈血測(cè)定空腹血糖水平(即時(shí)間為0 min)。然后,皮下注射葡萄糖(2 g/kg),并分別在葡萄糖注射后15、30、60、90和120 min時(shí)測(cè)定血糖濃度。以空腹血糖為基礎(chǔ),計(jì)算注射葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)的血糖變化率,以注射時(shí)間為橫坐標(biāo)、血糖相對(duì)變化率為縱坐標(biāo)繪制小鼠血糖調(diào)節(jié)曲線,所得的曲線下面積(AUC)表明各組動(dòng)物的糖耐量,曲線下面積的比較用于說(shuō)明糖耐量的變化[32]。

1.2.5紫甘藍(lán)花青素對(duì)OVX小鼠肝臟中葡萄糖-6-磷酸酶的調(diào)節(jié)作用。糖耐量測(cè)試后,小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉處死,解剖并取適當(dāng)大小肝臟組織,總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、定量PCR方法和數(shù)據(jù)處理等主要按照試劑盒提供的條件和實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)工作描述[32]。定量PCR所用的cDNA樣品量為50 ng/孔,反應(yīng)步驟采用兩步驟PCR,退火和鏈延伸溫度為60 ℃,反應(yīng)時(shí)間為30 s,反應(yīng)經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,利用熱溶解曲線判定反應(yīng)的專(zhuān)一性。所得CT值經(jīng)delt-delt CT方法分析,基因表達(dá)數(shù)值采用相對(duì)對(duì)照的相對(duì)變化倍數(shù)表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析除特別說(shuō)明外,該研究的每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)采用單向方差分析結(jié)合 Tukey’s post hoc 測(cè)驗(yàn)分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘藍(lán)花青素提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響。稱(chēng)取12份1 g的紫甘藍(lán),分別放入12個(gè)錐形瓶中,用酸化的水(即乙醇濃度為0)、10%、20%、40%、60%、75%乙醇作為提取液,每個(gè)濃度有2份材料。60 ℃下水浴6 h,提取3次,溶液離心后取上清,定容至25 mL,等比例稀釋后,測(cè)定530、620、650 nm波長(zhǎng)下溶液的OD值,計(jì)算花青素含量。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

從圖1可以看出,40%乙醇的花青素提取量顯著高于10%和20%的乙醇(P<0.05),并與60%、75%乙醇條件下沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。這表明在溫度維持60 ℃、料液比1∶15(g∶mL)、提取時(shí)間6 h的條件下,40%乙醇即可獲得最好的提取效果。

圖1 乙醇濃度對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the amount of anthocyanidin extracted from Brassica oleracea var．capitata rubra

2.1.2溫度對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響。稱(chēng)取8份1 g的紫甘藍(lán),每個(gè)溫度有2份材料,加入40%的酸化乙醇溶液7 mL,分別在25、40、55、70 ℃的水浴鍋中浸提3次,共6 h,離心后取上清,定容至25 mL,等比例稀釋后,測(cè)定530、620、650 nm 波長(zhǎng)下溶液的OD值,計(jì)算花青素含量。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

從圖2可以看出,溫度為40 ℃或以上時(shí),提取的花青素含量顯著高于25 ℃的提取條件(P<0.05),55 ℃時(shí)達(dá)到最大量,但55和70 ℃之間并無(wú)顯著差異(P>0.05)。這表明在提取時(shí)間6 h、料液比1∶15、乙醇濃度40%條件下,溫度在55 ℃時(shí)花青素提取量達(dá)到最大。

圖2 溫度對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響Fig.2 Effect of temperature on the amount of anthocyanidin extracted from Brassica oleracea var．capitata rubra

2.1.3提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響。稱(chēng)取10份1 g的紫甘藍(lán),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有2份材料,分別放入10個(gè)錐形瓶中,在60 ℃水浴鍋中,用40%乙醇溶液各7 mL分別浸提3次,提取時(shí)間分別為1、2、4、6和12 h,離心后取上清,定容至25 mL,等比例稀釋后,測(cè)定530、620、650 nm波長(zhǎng)下溶液的OD值,計(jì)算花青素含量。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

從圖3可以看出,4 h時(shí)提取液的提取量顯著高于1和2 h(P<0.05),與6、12 h條件下的處于同一水平(P>0.05)。這表明在溫度60 ℃、乙醇濃度40%和料液比1∶15條件下,提取時(shí)間為4 h時(shí)即可取得最多的花青素提取量。

圖3 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the amount of anthocyanidin extracted from Brassica oleracea var．capitata rubra

2.1.4料液比對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響。稱(chēng)取8份1 g的紫甘藍(lán),每個(gè)料液比有2份材料,分別加入適量40%的酸化乙醇(0.1 mol/L鹽酸),60 ℃條件下浸提3次,共6 h,分別定容至5、10、15、20、30 mL,即料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30,等比例稀釋后,測(cè)定530、620、650 nm波長(zhǎng)下溶液的OD值,計(jì)算花青素含量。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

從圖4可以看出,料液比為1∶15、1∶20、1∶30時(shí)提取的花青素多于1∶5、1∶10時(shí)的提取量(P<0.05),但1∶15、1∶20、1∶30之間并無(wú)顯著差異。換言之,料液比為1∶15、1∶20和1∶30花青素提取量基本相同,即最佳料液比為1∶15。

圖4 料液比對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the amount of anthocyanidin extracted from Brassica oleracea var．capitata rubra

2.2 紫甘藍(lán)花青素提取最佳條件的確定根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果,選擇提取時(shí)間(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)和溫度(D)4個(gè)主要因素,每個(gè)因素有3個(gè)水平,進(jìn)行正交試驗(yàn),具體如表2所示。每個(gè)試驗(yàn)條件組合試驗(yàn)2次,每次有3個(gè)重復(fù),以花青素含量為指標(biāo),正交試驗(yàn)結(jié)果和分析如表3～4所示。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

從表3和表4可以看出,各因素對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取量的影響由大到小依次為A>C>D>B,即提取時(shí)間>乙醇濃度>溫度>料液比,且各因素對(duì)花青素提取量的影響均達(dá)到顯著水平。最優(yōu)化水平組合為A2B3C3D3,即提取時(shí)間4 h、料液比1∶20、乙醇濃度60%、溫度70 ℃。

表4 方差分析

按照這一優(yōu)化試驗(yàn)條件,1 g紫甘藍(lán)所提取的花青素量為108 nmol,按花青素平均摩爾質(zhì)量800 g/mol計(jì)算,每1 kg紫甘藍(lán)中可提取出的花青素為148.8 mg,該含量與部分報(bào)道的紫甘藍(lán)中花青素提取量基本相當(dāng)[15-16]。目前南陽(yáng)新野產(chǎn)紫甘藍(lán)的產(chǎn)量約64 500 kg/hm2,即1 hm2新野紫甘藍(lán)可提取5 550 kg花青素。因此,新野產(chǎn)紫甘藍(lán)花青素含量豐富,具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,值得進(jìn)一步深加工和利用。

2.3 花青素提取液對(duì)OVX小鼠糖耐量的調(diào)節(jié)作用OVX手術(shù)可以導(dǎo)致小鼠體重增加,尤其是脂肪量增加[33]、血壓升高[34]、骨質(zhì)疏松[35]等癥狀,這些都是典型圍絕經(jīng)期的癥狀,在OVX動(dòng)物模型中也都得到體現(xiàn)[36]。花青素可防止肥胖、調(diào)節(jié)心血管功能等[2,37],對(duì)血糖水平具有明顯調(diào)節(jié)作用[17]。但OVX導(dǎo)致血糖變化的機(jī)理并不十分清楚。該研究首次利用OVX模型探討花青素對(duì)血糖的調(diào)節(jié)作用。從圖5可以看出,與假手術(shù)對(duì)照(Shm+H2O)相比,OVX(OVX+H2O)70 d后,動(dòng)物的糖耐量顯著下降,曲線下面積(AUC)升高37.2%;相較OVX+H2O組,普通甘藍(lán)處理組(OVX+BO)的AUC僅降低8.7%;雌激素(OVX+E2)和紫甘藍(lán)花青素(OVX+BOR)可以顯著恢復(fù)小鼠對(duì)血糖的調(diào)節(jié)作用,相較OVX+H2O組,OVX+E2和OVX+BOR組的AUC分別下降30.5%和31.6%,與假手術(shù)組的基本相當(dāng)。以上結(jié)果表明卵巢切除手術(shù)損壞了小鼠的糖耐量,紫甘藍(lán)的花青素可顯著提高糖耐量。

注:與Shm+H2O相比,*P<0.05。Note:Compared to Shm+H2O,* P<0.05.

2.4 花青素通過(guò)降低G6Pase表達(dá)改善OVX小鼠糖耐量肝臟中G6Pase是血糖水平調(diào)節(jié)的限速酶之一,可通過(guò)水解葡萄糖-6-磷酸產(chǎn)生葡萄糖,并釋放入血液,從而提高血糖水平。定量PCR用于研究G6Pase mRNA水平,結(jié)果表明(圖6),相較Shm+H2O組,OVX手術(shù)(OVX+H2O)顯著升高肝臟中G6Pase水平,升高了(5.22±1.02)倍,普通甘藍(lán)(OVX+BO)升高了(4.77±0.65)倍,紫甘藍(lán)花青素(OVX+BOR)組和補(bǔ)佳樂(lè)組(OVX+E2)分別升高了(2.40±0.34)和(1.82±0.18)倍;其中,OVX+BO組與OVX+H2O組沒(méi)有顯著差異,與OVX+H2O和OVX+BO組相比,OVX+E2組、OVX+BOR組均顯著降低了肝臟中G6Pase水平。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示的擴(kuò)張條帶(圖7)也可見(jiàn)類(lèi)似的結(jié)果,表明電泳上樣量比較接近。該研究的結(jié)果與馬基莓(Aristoteliachilensis)花青素的相關(guān)研究類(lèi)似[37]。

注:與Shm+H2O相比,*P<0.05;與OVX+H2O相比,# P<0.05。Note:Compared with Shm+H2O,* P<0.05;compared to OVX+H2O,# P<0.05.

圖7 各組中對(duì)照基因β-actin和目的基因G6Pase擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.7 Agarose electrophoresis results of control genes β-actin and target gene G6Pase amplification

3 結(jié)論與討論

該研究通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在酸化乙醇的條件下,乙醇濃度為40%、溫度為55 ℃、提取時(shí)間為4 h、料液比為1∶15時(shí),從紫甘藍(lán)中提取得到的花青素較多,該結(jié)果與Ghareaghajlou等[16]的研究結(jié)果類(lèi)似。該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn),結(jié)果表明,影響提取的因素主次分別為提取時(shí)間>乙醇濃度>溫度>料液比,最佳提取效果的條件為提取時(shí)間4 h、料液比1∶20、乙醇濃度60%、溫度70 ℃。該結(jié)果與王秋霜等[38]的研究結(jié)果比較吻合。按照上述正交試驗(yàn)的最佳條件,每1 kg紫甘藍(lán)中可得到148.8 mg花青素。參照該提取量和正常花青素市價(jià),正常情況下,紫甘藍(lán)花青素的經(jīng)濟(jì)效益一般優(yōu)于紫甘藍(lán)的蔬菜價(jià)值。

目前已經(jīng)有大量對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取的報(bào)道,但所顯示的含量變化幅度很大[16]。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因有多種。首先可能與紫甘藍(lán)的栽培地有關(guān),如不同海拔生長(zhǎng)藍(lán)莓(VacciniumcorymbosumL.)的花青素可因海拔的升高而增加[39],各文獻(xiàn)中的紫甘藍(lán)來(lái)自世界各地,生態(tài)環(huán)境的變化在所難免;另外,紫甘藍(lán)即使栽培在同一個(gè)地方,如河南新野產(chǎn)紫甘藍(lán),也會(huì)因生長(zhǎng)季節(jié)的變化而有差異。該研究所用的紫甘藍(lán)集中采集于3—6月,這些材料也可能與其他季節(jié)的有差異。更重要的是,花青素是多個(gè)成分的統(tǒng)稱(chēng),不同植物中的花青素種類(lèi)可能有不同;花青素本身相對(duì)不穩(wěn)定,對(duì)溫度、酸堿度、溶液種類(lèi)等測(cè)試條件的敏感度也不同[13,16,26],不同的提取方法也會(huì)造成提取產(chǎn)物穩(wěn)定性的不同[8]。這些原因不僅造成了測(cè)試和花青素保存等過(guò)程的差異,也與花青素進(jìn)入體內(nèi)后的生物利用度密切相關(guān),因此,進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝以及對(duì)紫甘藍(lán)中花青素的穩(wěn)定性研究是有效利用紫甘藍(lán)花青素的必要前提。

該研究首次發(fā)現(xiàn),紫甘藍(lán)花青素可通過(guò)抑制肝臟G6Pase的表達(dá)降低雌激素缺失條件下的血糖水平,從而緩解OVX模型動(dòng)物的糖耐量損傷,該結(jié)果與馬基莓(A.chilensis)中花青素功能的研究類(lèi)似[37]。同時(shí),已經(jīng)證明花青素也可以通過(guò)抑制腸道內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT2的表達(dá)和功能而降低葡萄糖的吸收,通過(guò)降低白脂肪中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT4的表達(dá)和功能而降低白脂肪中的葡萄糖進(jìn)入血液,并反饋抑制G6Pase的表達(dá),因此,花青素降低血糖是通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的[40]。該研究的結(jié)果證明紫甘藍(lán)花青素至少參與了其中血糖調(diào)節(jié)的部分環(huán)節(jié)。實(shí)際上,花青素還被證明參與了胰島素敏感性調(diào)節(jié)[8]、骨骼肌和心肌對(duì)血糖的吸收[14,40]等環(huán)節(jié),從而改善肥胖和 Ⅱ 型糖尿病的病癥[2,8,14,40]。這些結(jié)果也為花青素調(diào)節(jié)血糖水平提供了佐證,花青素可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)增加或恢復(fù)了模型動(dòng)物或病人的血糖調(diào)節(jié)能力,使動(dòng)物和人能夠更好地適應(yīng)內(nèi)環(huán)境的變化。實(shí)際上,花青素還具有調(diào)節(jié)心腦血管活動(dòng)、抗腫瘤等功能[8,40]。

此外,紫甘藍(lán)也同樣具有普通甘藍(lán)的特點(diǎn),如低熱量、大量纖維、富含蛋白質(zhì)和維生素[41],可“補(bǔ)骨髓,利五臟六腑,利關(guān)節(jié),通經(jīng)絡(luò)中結(jié)氣,明耳目,健人,少睡,益心力,壯筋骨,去心下結(jié)氣”[42]。因此,紫甘藍(lán)可兼具甘藍(lán)和花青素的多種功能。該研究采用了具有圍絕經(jīng)病癥的OVX動(dòng)物模型,由于圍絕經(jīng)期被認(rèn)為是個(gè)體的慢性炎癥導(dǎo)致神經(jīng)退化和心血管疾病頻發(fā),花青素可以通過(guò)抗炎等作用緩解更年期癥狀,而且截至目前,花青素尚未被發(fā)現(xiàn)有明顯副作用[13]。該研究從花青素抑制肝臟G6Pase的角度證實(shí)了雌激素缺失條件下花青素改善血糖平衡的部分機(jī)理,表明紫甘藍(lán)是改善更年期癥狀的優(yōu)秀藥食兩用材料,未來(lái)對(duì)于紫甘藍(lán)花青素的功能、穩(wěn)定性和生物利用度的進(jìn)一步研究將為更好利用紫甘藍(lán)提供依據(jù)。