黑曲霉和酒糟二次發酵提升低次煙葉品質的研究

邵燈寅,李雨芮,鄒恩凱,陳 棟,何 力,楊 蕾,羅海濤*

(1.江西中煙工業有限責任公司技術中心,江西南昌 330096;2.云南農業大學煙草學院,云南昆明 650201)

近年來,工業中低次煙葉庫存逐年增加,這極大地阻礙了卷煙行業的發展,有效提升工業庫存低次煙葉的品質已經成為煙草行業的一個研究重點。目前,微生物發酵法因具有不受氣候條件限制、生產周期短、對環境友好等[1]優點而在我國煙草生產過程中廣泛應用。低次煙葉具有刺激性大,伴有較強的生煙感和生青雜氣等特點[2]。全銘沁等[3]研究表明黑曲霉發酵液更適合用于降低煙葉的刺激性。許春平等[4]的研究也證實再造煙葉經過黑曲霉降解后煙葉的刺激性明顯減輕。黑曲霉(Aspergillusniger)在煙葉發酵中主要用于降低煙葉中淀粉與蛋白質、果膠以及纖維素的含量[5],使之進一步轉化分解為葡萄糖等物質,從而降低煙葉的刺激性[6]。

黑曲霉雖然對煙葉的刺激性有較好的改善效果,但黑曲霉無法有效改善低次煙葉中的生青雜氣[3],且被其處理后的煙葉勁頭明顯不足。研究發現,用酒糟發酵食醋時會產生甘油、脂肪酸等香味物質[7],同時酒糟還能為多種有利于煙葉醇化的微生物提供優質氮源、碳源[8],其在發酵過程中還能提高一些蛋白酶的活性[9]。酒糟中含有豐富的礦物質以及鈣、鐵等微量元素,還含有多種菌體自溶產生的各種生物活性物質(如類脂化合物、酶等)[10]。以上這些特性理論上能夠很好地彌補黑曲霉發酵煙葉時的不足,但目前我國對酒糟發酵提質的研究主要集中在牲畜飼料的提質方面,而用于煙葉提質方面的研究較少。為了探究黑曲霉和酒糟二次發酵對低次煙葉的提質效果,筆者利用黑曲霉和自釀米酒酒糟對煙葉進行二次發酵處理,以期為減輕低次煙葉的庫存壓力提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1煙葉原料。庫存低檔次上部煙葉,產地為云南大理劍川,由江西中煙技術中心提供。

1.1.2發酵微生物制劑。黑曲霉,實驗室保存;米酒酒糟,自制。

1.1.3煙葉液體培養基。將煙葉剪成碎片后用無菌水37 ℃下浸泡12 h,在100 mL培養基中加入0.5 g煙葉碎片,置于115 ℃壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min,制成液體培養基,用于培養黑曲霉。

1.2 主要儀器與設備低溫離心機,為深圳瑞沃德生命科技有限公司產品;連續流動分析儀,為德國布朗盧比公司產品;氣相色譜-質譜聯用儀,為美國安捷倫公司產品;同時蒸餾萃取裝置,為鄭州科技玻璃儀器廠產品;旋轉蒸發儀為上海亞榮生化儀器廠產品;恒溫恒濕箱,為德國賓德公司產品;QS-Ⅱ試樣切絲機,為鄭州天宏自動化技術有限公司產品;加料泵;填煙器為德國GIZEH金字塔填煙器;立體壓力蒸汽滅菌器,為上海申安醫療器械廠產品。

1.3 方法

1.3.1樣品處理。①黑曲霉菌懸液的制備。挑選黑曲霉單菌落接種至10 mL煙葉液體培養基中,培養至OD600為0.6～0.8(即對數期),離心(4 ℃,4 500 r/min)后將菌體重懸在1 mL 10%葡萄糖溶液(無菌水配制),得到菌懸液。②黑曲霉預處理煙葉的方法。稱取含水率12%的煙葉碎片30 g,噴施6 mL制備好的黑曲霉菌懸液,對照樣品噴施等量無菌水。將處理后的樣品煙葉和對照煙葉裝入無菌食品袋中,于溫度28 ℃、濕度60%恒溫恒濕培養箱中發酵12 h。③自釀米酒酒糟發酵處理煙葉的方法。將煙葉碎片平鋪開(盡量不要重疊)并把酒糟涂抹在煙葉碎片上,蓋上4層紗布,置于28 ℃培養箱中培養5 d。

1.3.2試驗方法。將各處理的煙葉切絲并取適量煙絲進行化學成分和致香成分分析,剩余部分煙絲制成卷煙,用于后續的感官評價。對比各處理前后的煙葉常規化學成分、致香成分和感官質量的變化,確定通過提質處理后煙葉總體品質的提升效果。試驗處理設計見表1。

表1 試驗處理設計

1.3.2.1常規化學成分測定。參考YC/T 161—2002 《煙草及煙草制品 總氮的測定 連續流動法》、YC/T 160—2002 《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動法》、YC/T 159—2002 《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》、YC/T 217—2007 《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續流動法》、YC/T 162—2002 《煙草及煙草制品 氯的測定 連續流動法》對煙絲中常規化學成分(總氮、總植物堿、水溶性糖、還原糖、鉀、氯)進行測定。

1.3.2.2致香物質的測定及分類。致香物質的樣品處理方法與GC/MS分析條件參照文獻[11]的方法,以萘作為內標化合物。致香物質的分類方法參考文獻[12]。

1.3.2.3樣品評價。由專業評吸人員在同一時間分別對單料煙進行評吸,每次抽吸3支卷煙,對每個處理的單料煙進行3次評吸。以T1為對照(CK),對T2、T3處理香氣質、量的變化以及口感的改善等方面進行評價。

1.3.3數據處理。數據處理中采用LSD法進行多重比較;利用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26軟件進行數據統計與分析;使用OriginPro 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 常規化學成分分析煙葉的香氣主要反映煙葉的內在品質,煙葉的常規化學成分影響煙氣成分的釋放效果以及煙草的吃味[13-14]。由表2可知,T2、T3處理總氮、總植物堿、水溶性糖的含量與T1處理存在顯著差異,而T2、T3處理間差異不顯著。T1、T2、T3處理鉀和氯的含量變化不大;T2、T3處理煙葉的總氮、總植物堿含量較T1處理明顯下降,T2、T3處理水溶性糖、還原糖的含量較T1處理有所上升;T3處理總氮、總植物堿和還原糖的含量較T2處理略有下降,T3處理水溶性糖的含量較T2處理略有提升。

表2 各處理煙葉常規化學成分含量比較

優質烤煙煙葉化學成分標準如下:總植物堿含量為1.6%～3.0%、總氮含量為1.5%～2.3%、總氮與總植物堿的比值小于1、還原糖含量為8%～18%、還原糖與總植物堿的比值為3～7[15]。利用黑曲霉對煙葉進行預發酵后的低次煙葉化學成分含量幾乎達到優質煙葉的水平,這與趙銘欽等[6]的研究結果相吻合;通過酒糟進行二次發酵對預發酵煙葉常規化學成分含量的影響不大。

2.2 煙葉致香物質分析煙草香氣質量狀況是多種致香物質的組成、含量、比例及相互作用共同決定的[16]。參考文獻[4]方法將煙氣中致香物質大致分為質體色素降解產物、苯丙氨酸類降解產物、美拉德反應產物、西柏烷類降解產物和其他類致香物質5類,其中質體色素降解產物又可分為類胡蘿卜素降解產物和葉綠素降解產物。

2.2.1致香物質檢測分析。由表3可知,對T1、T2、T3處理煙葉進行致香成分檢測,分別檢測出37、41和40種致香物質,致香物質總含量分別為596.112、745.449和787.639 μg/g。與T1處理相比,T2、 T3處理煙葉的大部分致香物質含量明顯增加。其中,通過黑曲霉及酒糟發酵處理(T3)后植醇、新植二烯、β-大馬酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-甲基-1-丁醇、己醛、5-甲基-糠醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、茄那士酮、西柏三烯二醇、面包酮、肉豆蔻酸、正十六酸、棕櫚酸乙酯等致香物質的含量較T1處理均有所增加。與T1處理相比,T2處理植醇、藏紅花醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、苯甲醛、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、5-甲基-糠醛等致香物質含量的增加幅度超過20%,說明黑曲霉預處理后煙葉的主要致香物質含量明顯增加。酒糟二次發酵處理(T3)后的煙葉新植二烯含量較僅經過黑曲霉處理(T2)的煙葉明顯增加。新植二烯是葉綠素的降解產物,能夠減輕刺激并柔和煙氣,同時新植二烯還能夠協助煙氣中的其他揮發性香氣物質進入煙氣[13]。該結果也進一步證實黑曲霉發酵能夠降低煙葉的刺激性。

2.2.2各類別致香成分含量變化。由表4可知,發酵處理前后煙葉的主要致香物質除苯丙氨酸類降解產物外含量都存在明顯變化,其中其他類致香物質的變異系數最大,為45.554%;苯丙氨酸類降解產物含量的變異系數最小,變異系數為7.705%。其他類致香物質含量最高,美拉德反應產物的含量最低。由表5可知,除西柏烷類降解產物外,T2、T3處理的葉綠素降解產物、類胡蘿卜素降解產物、苯丙氨酸類降解產物、美拉德反應產物、其他類致香物質的含量均高于T1處理,其中葉綠素降解產物、其他類致香物質和類胡蘿卜素降解產物的含量明顯增加,這對于煙葉香氣質量有著非常明顯的正向作用[17]。

表4 煙葉主要致香物質含量分析

表5 各處理主要致香物質含量的比較

2.3 感官質量評價結果各處理感官評價結果如下:T1,生煙感比較強,生青、木質雜氣明顯,青滋香稍重,鼻腔刺激明顯,口腔有苦澀感;T2,舌面刺激減小、勁頭稍顯不足、煙香成熟感有所增加、香氣醇和感明顯提升、余味回甘回甜、有其他香氣產生、略有清香;T3,提升煙香成熟感的作用明顯,香氣透發性、質感均有所提升,甜潤感增加,清香偏弱,烤甜香增加,香氣整體協調,煙香醇和感明顯提升,余味舒適,品質提升明顯。由此可見,T2、T3處理煙葉感官質量相較于T1處理顯著提升,而T3處理煙葉感官質量較T2處理也有明顯改善。T2處理相較于T1處理煙葉感官質量的上升主要體現在刺激性明顯下降且煙香更加協調,而T3處理相較于T2處理煙葉感官質量的改善主要體現在香氣質感和整體協調性的上升。總體來看,感官質量的改善主要體現在煙葉刺激性的降低以及生青雜氣的掩飾;經過處理的煙葉甜感和煙香成熟感逐漸增加,清香型風格逐漸變弱,煙氣的烤甜香逐漸增加。二次發酵雖然能使煙葉香氣協調且能提升煙氣的質感、醇和性以及透發性,但是煙葉的清香風格可能會被掩蓋,烤甜香會有所增加。

3 結論

經酒糟與黑曲霉二次發酵處理的低次煙葉相較于未經處理的低次煙葉無論從化學成分、致香物質的種類及含量還是感官質量方面都有較大提升,雖然處理后的煙葉清香風格會有所掩蓋,但總體來看經過該方法處理的低次煙葉能夠很好地改善煙葉品質。該試驗結果可為后續酒糟發酵及黑曲霉發酵工藝在工業中的進一步應用提供有力的理論支持,今后還要進一步完善其中試放大工藝條件,以加快其在低次煙葉提質中的推廣應用。