銀杏葉提取物對結(jié)腸癌患者SW480細(xì)胞增殖的影響

關(guān)毅，暢立強(qiáng)

1.新疆五家渠第六師總醫(yī)院普外一科，新疆五家渠 831300；2.山西省中醫(yī)藥研究院肛腸科，山西太原 030001

結(jié)腸癌發(fā)生原因復(fù)雜多樣，涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等因素[1]。結(jié)腸癌通常發(fā)生在50歲以上的人群中[2]，年齡是結(jié)腸癌的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。男性比女性更容易患結(jié)腸癌。結(jié)腸癌是一種惡性腫瘤，如果不及時(shí)治療，腫瘤會(huì)繼續(xù)生長和擴(kuò)散，甚至?xí)鹉c梗阻、穿孔和腹膜轉(zhuǎn)移等嚴(yán)重后果，對患者的健康造成嚴(yán)重的危害。且結(jié)腸癌的早期癥狀不明顯，可能只有輕微的腹瀉、腹痛或不適，或者沒有任何癥狀。一旦病情發(fā)展到晚期，治療難度會(huì)增加，患者的生存率也會(huì)大大降低[3-4]。因此，對結(jié)腸癌而言，最關(guān)鍵的是采取高效的治療藥物或方式進(jìn)行治療。銀杏葉提取物是當(dāng)前臨床治療結(jié)腸癌的一種常用藥物成分[5]。為此，本文選擇2022年1—12月新疆五家渠第六師總醫(yī)院的10份結(jié)腸癌標(biāo)本為研究對象，就銀杏葉提取物對結(jié)腸癌患者SW480細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行臨床研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

選擇本院10份結(jié)腸癌標(biāo)本為研究對象，以及中國南京博瑞公司所產(chǎn)的銀杏葉提取物EGB761，濃度稀釋所用的材料為二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）。另準(zhǔn)備南通碧云天生物科技公司所產(chǎn)的高糖DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞增殖和毒性檢測劑盒（CCK-8）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、RIPA細(xì)胞裂解液、胰蛋白酶溶液，同時(shí)使用美國Santa Cruz公司所產(chǎn)的兔抗人多克隆抗體Ki67和小鼠抗人單克隆抗體PCNA以及江蘇南通碧云天生物科技公司生產(chǎn)的β-actin抗體。

1.2 方法

在檢測銀杏葉提取物EGB761對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的細(xì)胞增殖抑制率之前，預(yù)先制備1×105/mL的細(xì)胞懸液并將其接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。經(jīng)過24 h的37℃、5%CO2培養(yǎng)，每孔分別加入0.5 mg/mL不同質(zhì)量的銀杏葉提取物為銀杏葉提取物組，劑量分別為20、40、60、80、100 μL，從而獲得100、200、300、400、500 mg/L的濃度，上述的每個(gè)濃度都設(shè)置了3個(gè)重復(fù)孔，另設(shè)對照組（DMSO），數(shù)量與以上相等。將相應(yīng)的空白孔調(diào)零，操作人員將不同濃度的銀杏葉提取物分別處理細(xì)胞2 d、3 d后，在每個(gè)孔中將10 μL CCK-8試劑加入并培養(yǎng)3 h，之后對各孔的吸光度（optical density,OD）值進(jìn)行檢測，檢測時(shí)的酶標(biāo)儀波長為450 nm，同時(shí)將培養(yǎng)液作為空白對照并調(diào)零。最后，通過計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（inhibition rate, IR），即IR=（1-各銀杏葉提取物組吸光度均值/空白對照組吸光度均值）×100%，來比較不同濃度銀杏葉提取物對細(xì)胞增殖的影響。每個(gè)樣本均測量了3次并取平均值，以評估不同組之間的差異。

Western Blot的具體檢測方法為：用RIPA細(xì)胞裂解液提取不同組別的SW480細(xì)胞總蛋白，然后用分光光度儀測量蛋白質(zhì)濃度。接下來，將蛋白樣品進(jìn)行加熱變性處理，然后進(jìn)一步實(shí)施聚丙烯酰胺凝膠電泳，成功完成電泳操作之后間蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上封閉處理2 h，再將兔抗人Ki67和羊抗人PCNA的一級抗體加入，在4℃過夜后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的鼠抗兔及鼠抗羊二級抗體室溫下孵育0.5 h。經(jīng)PBS洗滌3次后，用ECL發(fā)光顯影方法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

1.3 觀察指標(biāo)

①100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后其吸光度、抑制率，并與空白對照組比較；②比較不同濃度下活性氧（reactive oxygen species,ROS）、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP）mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度銀杏葉提取物對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制率的影響

200、300、400、500 mg/L濃度時(shí)的吸光度與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.106、11.474、12.135、13.966，P＜0.05）。100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后的抑制率分別與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=76.963、31.821、29.747、29.461、33.614，P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度銀杏葉提取物對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 不同濃度銀杏葉提取物對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

注：*與空白對照比較，P＜0.05。

項(xiàng)目吸光度450抑制率（%）空白對照組（n=10）1.125±0.139 0.002±0.001銀杏葉提取物組（n=10）100 mg/L 1.145±0.214（3.020±0.124）*200 mg/L（0.943±0.018）*（12.500±1.242）*300 mg/L（0.616±0.017）*（40.000±4.252）*400 mg/L（0.571±0.039）*（43.100±4.626）*500 mg/L（0.508±0.014）*（45.200±4.252）*

2.2 各組ROS 、XIAP mRNA 表達(dá)水平比較

100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后的ROS、XIAP mRNA表達(dá)水平與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組ROS、XIAP mRNA 表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組ROS、XIAP mRNA 表達(dá)水平比較(±s)

注：*與空白對照比較，P＜0.05。

項(xiàng)目ROS（ng/μl）XIAP mRNA空白對照組（n=10）213.73±14.64 6.26±0.63銀杏葉提取物組（n=10）100 mg/L（263.46±16.79）*（5.89±0.52）*200 mg/L（295.76±20.37）*（5.24±0.53）*300 mg/L（362.63±21.88）*（4.36±0.45）*400 mg/L（475.45±22.74）*（3.36±0.75）*500 mg/L（503.55±23.39）*（2.86±0.22）*

3 討論

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，成為了全球健康領(lǐng)域的重要問題。隨著近年臨床對結(jié)腸癌的深入研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與SW480細(xì)胞增殖有著密切的聯(lián)系，而銀杏葉提取物能夠有效地抑制SW480細(xì)胞增殖，因此對結(jié)腸癌具有良好的治療效果[6-7]。

SW480細(xì)胞是一種人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞株，最初是從1例50歲男性的腸癌組織中分離而得，研究表明，SW480細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：①高度惡性，SW480細(xì)胞具有高度的轉(zhuǎn)移和浸潤性，是一種典型的惡性腫瘤細(xì)胞。②易于培養(yǎng)，SW480細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)，增殖迅速，適合進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。③易于轉(zhuǎn)染，SW480細(xì)胞對轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化病毒非常敏感，使其成為研究癌基因和腫瘤抑制基因的理想細(xì)胞模型[8-9]。

SW480細(xì)胞的快速增殖和易于轉(zhuǎn)染等特點(diǎn)使其成為研究結(jié)腸癌和腫瘤生物學(xué)的理想細(xì)胞模型，歸納起來，SW480細(xì)胞在結(jié)腸癌研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①藥物篩選，SW480細(xì)胞可以用于篩選針對結(jié)腸癌的藥物，并評估其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果[10]。②基因功能研究，SW480細(xì)胞對轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化病毒敏感，可以用于研究癌基因和腫瘤抑制基因的功能和相互作用。③信號通路研究，SW480細(xì)胞是Wnt/β-catenin通路過度激活的典型模型，可以用于研究該通路在結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。④腫瘤免疫學(xué)研究，SW480細(xì)胞可以用于研究腫瘤免疫學(xué)，包括研究腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制和開發(fā)針對腫瘤的免疫治療方法[11-12]。

銀杏葉提取物是一種天然藥物，已廣泛應(yīng)用于許多疾病的治療。銀杏葉提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，近年來臨床發(fā)現(xiàn)[8]，銀杏葉提取物對SW480細(xì)胞增殖有著很大的影響。歸納起來，銀杏葉提取物主要通過以下幾個(gè)方面對SW480細(xì)胞增殖發(fā)揮作用：①抑制細(xì)胞周期，銀杏葉提取物可能通過抑制細(xì)胞周期來抑制SW480細(xì)胞的增殖。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可以抑制SW480細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，從而阻礙其細(xì)胞分裂和增殖。②誘導(dǎo)凋亡，銀杏葉提取物可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制SW480細(xì)胞的增殖。

孫小虎等[13]在其研究報(bào)道中稱，銀杏葉提取物可以通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值來誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的凋亡；也可抑制Wnt/β-catenin通路，Wnt/β-catenin通路在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

相關(guān)研究表明，銀杏葉提取物可以通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制SW480細(xì)胞的增殖[14]。因此，銀杏葉提取物能有效抑制結(jié)腸癌患者SW480細(xì)胞增殖，并且可能通過多種作用機(jī)制來發(fā)揮其生物學(xué)活性，同時(shí)，不同的濃度所產(chǎn)生的效果也各不相同，通常情況下是在400 mg/L以上時(shí)抑制效果最佳，本研究結(jié)果顯示，在100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后其吸光度持續(xù)下降，200、300、400、500mg/L濃度時(shí)的吸光度與空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后的抑制率持續(xù)升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與以上結(jié)論相符，進(jìn)一步證實(shí)了銀杏葉提取物能有效抑制結(jié)腸癌患者SW480細(xì)胞增殖。

李靈等[15]表明，在400 ml/L濃度時(shí)，ROS通常可達(dá)到480 ng/μl左右，XIAP mRNA則可控制在3.5左右。在本次研究中，不同濃度下ROS、XIAP mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），分析其原因，ROS在細(xì)胞中發(fā)揮重要的生理功能，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等過程。然而，過量的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞死亡，在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生抑制作用。XIAP是一種抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，能夠與多種凋亡信號通路的關(guān)鍵蛋白相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)行。在腫瘤細(xì)胞中，XIAP的過度表達(dá)與抗凋亡能力的增強(qiáng)以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。銀杏葉提取物可以影響結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的ROS水平和XIAP信號通路。而銀杏葉提取物的抗氧化特性則能夠增加細(xì)胞內(nèi)ROS的生成或抑制ROS的清除，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的平衡狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，銀杏葉提取物還能夠下調(diào)XIAP的表達(dá)水平，減少其與凋亡信號通路關(guān)鍵蛋白的結(jié)合，從而解除對細(xì)胞凋亡的抑制作用，這一結(jié)論也與李靈等[15]所報(bào)道的結(jié)果相符。

綜上所述，銀杏葉提取物可對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為濃度和時(shí)間依賴性地抑制。