環狀RNA的表達在非小細胞肺癌細胞中的作用及機制研究

劉國華

齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院呼吸二科，黑龍江齊齊哈爾 161000

肺癌是臨床常見的呼吸系統惡性腫瘤，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是其主要病理類型，由于缺乏早期診斷，約75%的患者發現時已處于中晚期，5年生存率很低[1-3]。因此，有必要對NSCLC發生發展的分子機制有更全面的認識，以尋找可靠有效的治療靶點和早期生物標志物。CircRNA是一種新發現的非編碼環狀RNA，在細胞中廣泛表達，并具有基因調控的作用[4-5]。有研究證實CircRNAs在腫瘤的發生發展過程中，通過miRNA來調控基因的表達[6-8]。基于此，本研究的目的旨在探究CircRNA NFIX在NSCLC的作用及其分子機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肺泡上皮細胞BEAS-2B購自上海ATCC細胞庫，陽離子脂質體2000均購自GIBCO公司，載體均由金斯瑞公司合成。CCK-8試劑購自DOJINDO，細胞凋亡試劑盒購自BD公司，Trizol試劑及逆轉錄試劑盒購自invitrogen公司，抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

使用完全培養基（DMEM+10%FBS）培養A549細胞，以2×105個/mL密度接種24孔板中，37℃，5%CO2，參照Lipofectamine 2000試劑說明書將pLCDH-CircRNA NFIX、pLCDH、si-CircRNA NFIX、si-control、pLCDH-CircRNA NFIX +miR-132-3p mimics、pLCDH-CircRNA NFIX +miR-control、miR-132-3p mimics、miR- control分別通過轉染至A549細胞，分別命名為pLCDH-CircRNA NFIX組（A組）、pLCDH組（A-對照組），si-CircRNA NFIX 組（B組）、si-control組（B-對照組）、pLCDH-CircRNA NFIX+miR-132-3p mimics組（C組）、pLCDH-CircRNA NFIX +miR- control組（C-對照組），每組設置9個復孔，24 h后收集待用。

1.3 觀察指標

①LncRNA RMRP的表達：提取細胞總RNA，逆轉錄cDNA并作為PCR的模板，以熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，計算LncRNA RMRP的相對量。②細胞增殖率及凋亡率：CCK-8檢測細胞增殖率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。③炎癥因子：按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表達水平。④蛋白表達：Western blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行處理，符合正態分布的計量資料用（±s）表示，行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CircRNA NFIX對非小細胞肺癌細胞A549的作用

與對照組相比，A組CircRNA NFIX過表達，細胞存活率、Bcl-2、IGF1R表達顯著升高，細胞凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達顯著降低，B組CircRNA NFIX沉默表達，細胞存活率、Bcl-2、IGF1R蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達

表1 CircRNA NFIX對非小細胞肺癌細胞A549增值及凋亡的影響(±s)

表1 CircRNA NFIX對非小細胞肺癌細胞A549增值及凋亡的影響(±s)

注：與A-對照組和對照組相比較，*P＜0.05；與B-對照組和對照組相比較，#P＜0.05。

組別對照組（n=9）A-對照組（n=9）A組（n=9）B-對照組（n=9）B組（n=9）CircRNA NFIX 1.00±0.12 1.01±0.11（2.12±0.24）*1.01±0.13（0.41±0.04）#細胞凋亡率（×10-2）4.25±0.45 4.28±0.44（3.14±0.01）*4.19±0.41（8.31±0.96）#細胞存活率（×10-2）96.24±1.25 95.87±1.24（100.58±1.57）*95.38±1.26（83.54±1.15）#IGF1R 1.02±0.44 1.00±0.46（2.88±1.41）*1.01±0.44（0.48±0.06）#

2.2 CircRNA NFIX靶向miR-132-3p對非小細胞肺癌細胞A549的作用

與C-對照組相比較，C組細胞存活率、Bcl-2、IGF1R蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 CircRNA NFIX靶向miR-132-3p對非小細胞肺癌細胞A549增值及凋亡的影響(±s)

表2 CircRNA NFIX靶向miR-132-3p對非小細胞肺癌細胞A549增值及凋亡的影響(±s)

組別C組（n=9）C-對照組（n=9）t值P值miR-132-3p 1.01±0.10 0.39±0.05 16.636＜0.001細胞凋亡率（×10-2）4.59±0.76 3.10±0.30 5.471＜0.001細胞存活率（×10-2）95.11±1.21 100.96±1.57 8.854＜0.001 IGF1R 1.01±0.45 2.82±1.35 3.816 0.002

3 討論

CircRNA具有多種生物學功能，同樣也參與腫瘤的發生和發展，如Circ-AGFG1通過“海綿”miR-195-5p調節CCNE1的表達，促進三陰乳腺癌的進展[9-10]。在肝細胞中，has_circ_0078710作為miR-31海綿作用促進細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長[11-12]。CircRNA NFIX是CircRNA的一種，被證明與心肌再生有關[13-14]。CircRNA NFIX同樣也參與腫瘤的發生和發展，CircRNA NFIX通過Notch信號通路調控miR-34a-5p促進膠質瘤進展[15-17]。Xu H等[18]的研究指出，circNFIX是唯一在膠質瘤中過表達的circRNA，流式細胞儀檢測顯示，與NC相比，si-circNFIX可以促進細胞凋亡。同樣，miR-34a-5p可以減輕si-circNFIX的抑制作用（P＜0.05）。CCK8檢測結果表明sicircNFIX抑制細胞增殖，而miR-34a-5p抑制劑促進細胞增殖，至今，CircRNA NFIX在NSCLC中作用尚未被探究，本研究首先選擇非小細胞肺癌細胞株A549，過表達CircRNA NFIX可以顯著抑制細胞凋亡，促進肺癌細胞體外增殖，而采用si-RNA干擾技術沉默CircRNA NFIX表達可以顯著促進細胞凋亡，抑制肺癌細胞體外增殖，故可證實CircRNA NFIX在非小細胞肺癌中扮演癌基因的作用，并研究miR-132-3p與CircRNA NFIX過表達對A549細胞的增殖和凋亡影響，結果發現過表達miR-132-3p可以抑制CircRNA NFIX對A549細胞的促增殖作用，進一步證實CircRNA通過海綿結合miR-132-3p發揮對腫瘤細胞的作用，通過對不同組轉染細胞中IGF1R表達量檢測發現，CircRNA NFIX通過海綿結合miR-132-3p，進一步調節基因IGF1R起作用。

綜上所述，環狀RNA CircNFIX在非小細胞肺癌中發揮重要的作用，RNA CircNFIX有望成為非小細胞肺癌靶向治療的新靶點。