氯硝柳胺抑制宮頸癌細胞增殖和遷移

羅艷林,陳義兵

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院 婦科,河南 鄭州 450008;2.鄭州大學基礎醫學院 臨床藥理研究所,河南 鄭州 450001;3.鄭州大學第一附屬醫院 婦產科,河南 鄭州 450052)

宮頸癌是全球第二常見的女性惡性腫瘤,近年來中國宮頸癌發病率和死亡率均呈上升趨勢及年輕化趨勢,2020年中國宮頸癌新發和死亡病例分別占全球發病和死亡總數的18.17%和17.28%,尤其晚期、復發轉移宮頸癌常規的手術、放化療效果欠佳,5 a生存率不足20%,治療手段有限,急需新的治療手段[1-2]。為了克服這些局限性,探尋針對靶向癌癥病程發生與發展過程中的相關信號轉導通路的新治療方法是改善宮頸癌預后的關鍵因素。細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可影響多種生物過程,包括細胞增殖、遷移、分化和炎癥反應等[3]。研究表明EMT在各種惡性腫瘤進展中起了重要作用,包括結直腸癌、食管癌、乳腺癌、腦癌、子宮內膜癌、宮頸癌等[4-5]。

氯硝柳胺對絳蟲特別有效,已被用來治療絳蟲感染近50年[6];近年來,氯硝柳胺已被確定為一種潛在的抗癌藥物[7]。最近有研究報道,氯硝柳胺對乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌和血液腫瘤等都顯示出抗腫瘤活性[8-12]。也有研究表明氯硝柳胺能夠抑制宮頸癌細胞的增殖,且能夠逆轉宮頸癌細胞對紫杉醇的耐藥[13],但具體的作用機制并不十分明晰。因此,本研究旨在探討氯硝柳胺對宮頸癌的影響和潛在抗腫瘤作用的分子機制,這可能對宮頸癌的治療有價值,并為特定抑制劑的開發提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人宮頸癌細胞系HeLa、SiHa購自中國科學院細胞庫,其中HeLa細胞來源于人子宮頸腺癌組織,含有人乳頭瘤病毒18型基因序列,SiHa細胞來源于人子宮頸鱗癌組織,含有人乳頭瘤病毒16型基因序列;10%胎牛血清(Gibco)、DMEM培養基(Gibco)均購自美國Thermo公司;氯硝柳胺購自美國Selleck Chemicals,抗體Vimentin和N-Cadherin、Actin 購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 細胞培養和藥物處理

HeLa、SiHa細胞培養在體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養,每隔2～3 d傳代培養1次。將氯硝柳胺溶解于無菌二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中,配置成20 mmol·L-1的儲備溶液,將其儲存于-20 ℃,使用時用細胞培養基稀釋。

1.3 MTT檢測

取對數生長期濃度為5×104個·mL-1的SiHa、HeLa細胞接種于96孔板中,每孔100 μL。在培養箱中培養12～16 h后,分別用0、1、2、4 μmol·L-1的氯硝柳胺處理SiHa、HeLa細胞,每種濃度平行5孔,各組實驗重復3次。各處理組分別在加藥后24、48、72 h后加20 μL新鮮的MTT(5 g·L-1)溶液處理,37 ℃孵育4 h后,吸掉上清,用150 μL DMSO溶液溶解紫色結晶沉淀物,振蕩混勻后置于酶標儀上選取波長570 nm測定吸光度(A)值。細胞存活率(%)為實驗組A值除以對照組A值乘以100%。

1.4 細胞劃痕試驗

將生長狀態良好的SiHa、HeLa細胞按照每孔5×105接種在35 mm培養皿中,每組設置3個平行樣。放置在體積分數5% CO2的37 ℃培養箱中培養至細胞接近飽和后,加藥處理后用無菌的200 μL槍頭在每皿中劃出等寬的直線劃痕,無菌PBS清洗后加新鮮培養基,并用0.5 μmol·L-1的氯硝柳胺分別處理SiHa、HeLa細胞,體積分數為0.05%的DMSO處理作為對照組。處理后繼續培養24 h,在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度,實驗重復3次。

1.5 Western blot

用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化各組細胞,離心收集細胞沉淀,用RIPA緩沖液置于冰上裂解。通過Bradford染料法測定蛋白質濃度。將等量(20～40 μg)細胞提取物在100 g·L-1SDS-PAGE中電泳,并轉移至硝酸纖維素膜(Millipore,HATF00010)進行轉膜,100 mA恒流轉移2 h,用50 g·L-1BSA室溫封閉1 h,搖床上TBST洗脫3次,每次5 min。一抗用抗體稀釋液1∶500稀釋,4 ℃孵育過夜,取出膜,搖床上TBST洗脫3次,每次5 min。二抗用50 g·L-1BSA 1∶10 000稀釋,搖床上室溫孵育1 h。搖床上TBST洗脫,室溫3次,每次10 min。ECL顯色,A液和B液1∶1混合,顯影成像。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 氯硝柳胺抑制人宮頸癌細胞增殖

MTT實驗結果顯示,4 μmol·L-1的氯硝柳胺處理HeLa細胞48、72 h后,細胞活力分別是(24.15±1.13)%和(16.22±2.63)%,4 μmol·L-1的氯硝柳胺處理SiHa細胞48、72 h后,細胞活力分別是(37.23±1.52)%和(23.18±2.82)%。隨著氯硝柳胺濃度的升高和處理時間的延長,氯硝柳胺對HeLa和SiHa細胞的抑制率越來越高,HeLa和SiHa細胞活力越來越低,氯硝柳胺呈濃度和時間依賴方式抑制宮頸癌細胞系SiHa和HeLa的增殖。見圖1。

A為MTT法測定HeLa細胞的細胞活力;B為MTT法測定SiHa細胞的細胞活力;各組實驗重復3次,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 氯硝柳胺抑制人宮頸癌細胞遷移

細胞劃痕試驗結果顯示,0.5 μmol·L-1的氯硝柳胺處理HeLa細胞48 h后,細胞的遷移率為(41.61±12.34)%,而此時對照細胞遷移率為(70.58±3.19)%,氯硝柳胺處理使HeLa細胞遷移率降低(t=3.937,P=0.017)。0.5 μmol·L-1的氯硝柳胺處理SiHa細胞48 h后,細胞的遷移率為(13.26±3.87)%,而此時對照細胞遷移率為(68.92±8.92)%,氯硝柳胺處理使SiHa細胞遷移率降低(t=9.915,P<0.001)。見圖2。

A為細胞劃痕試驗測定HeLa細胞遷移能力;B為細胞劃痕試驗測定SiHa細胞遷移能力。

2.3 氯硝柳胺抑制HeLa和SiHa細胞中EMT蛋白表達

Western blot結果顯示,氯硝柳胺處理HeLa和SiHa細胞48 h后,氯硝柳胺抑制N-Cadherin和Vimentin表達,并且隨著氯硝柳胺的濃度升高,對N-Cadherin和Vimentin表達抑制程度也越高。見圖3。

A為Western blot檢測HeLa細胞N-Cadherin和Vimentin表達;B為Western blot檢測SiHa細胞N-Cadherin和Vimentin表達。

3 討論

宮頸癌發病率和死亡率高,嚴重威脅女性健康。盡管早期宮頸癌通過手術或放化療等能達到較好的效果,但是晚期、轉移和復發宮頸癌無有效治療手段,預后差,急需開發新的治療手段來改善患者的預后。近50年來,氯硝柳胺用于人體和動物絳蟲感染,為治療牛帶絳蟲、闊節裂頭絳蟲、短小膜殼絳蟲等感染的良好藥物[14]。值得注意的是,許多體外和體內研究表明,通過失活多種信號通路證實氯硝柳胺具有潛在的抗癌活性[15]。已有眾多研究結果表明,氯硝柳胺對乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、頭頸癌等具有抗腫瘤活性[16-17],然而潛在的分子機制仍然知之甚少。本研究結果顯示氯硝柳胺以劑量依賴性和時間依賴性方式降低宮頸癌細胞活力,抑制宮頸癌細胞轉移,促進宮頸癌細胞凋亡,這一發現顯示氯硝柳胺可有效抑制宮頸癌。

從最初的藥物發現到最終用藥的藥物開發過程代價高昂,費時費力。與從頭開始的新藥研發相比,尋找老藥或天然藥物的新用途更加經濟、安全、高效[18-20]。不同課題組的多項研究表明氯硝柳胺可抑制多種分子和信號通路發揮抗腫瘤作用,包括核因子κB信號通路、mTOR信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、STAT3信號通路的信號轉導和激活以及Notch等信號通路[21-22]。有研究報道,氯硝柳胺通過Wnt/β-catenin信號通路逆轉食管癌對紫杉醇藥物抵抗[23]。另有研究報道,氯硝柳胺通過誘導GSK3-β調控的β-catenin泛素化降解來抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移,同時能夠提高吉西他濱對胰腺癌細胞治療的敏感性并減少胰腺癌免疫逃逸的發生[24]。另一項研究顯示,對于去勢治療抵抗的前列腺癌,體內、體外實驗均證明氯硝柳胺可通過抑制FOXM1介導的DNA損傷修復系統來發揮抗腫瘤作用[25]。

然而,氯硝柳胺對宮頸癌細胞的作用及可能的作用機制尚不完全清楚。EMT是重要的信號轉導通路,包括Vimentin和N-Cadherin蛋白,與細胞的異常增殖、進展密切相關[26]。大量研究表明,EMT信號通路在惡性腫瘤細胞和組織中均異常表達,并參與惡性腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移和治療抵抗[27]。本研究發現氯硝柳胺能夠抑制Vimentin和N-Cadherin蛋白表達,氯硝柳胺在SiHa和HeLa細胞系中以劑量依賴性方式抑制Vimentin和N-Cadherin蛋白,初步推測,氯硝柳胺可能是通過抑制EMT信號通路來發揮其對宮頸癌的抑制作用。既往研究也有報道氯硝柳胺聯合或不聯合順鉑均可通過抑制EMT抑制鉑敏感和鉑耐藥型三陰性乳腺癌的增殖,尤其是鉑耐藥型三陰性乳腺癌[28]。本研究僅在體外進行,還需要在體內實驗和臨床研究中進一步驗證其抗癌效應及可能分子機制,以協同方式評估其抗癌潛力,證實氯硝柳胺是否為治療宮頸癌的候選藥物之一。

4 結論

氯硝柳胺以劑量依賴性和時間依賴性方式降低宮頸癌細胞活力,抑制宮頸癌細胞轉移,促進宮頸癌細胞凋亡,抑制Vimentin和N-Cadherin蛋白表達,可能成為一種新的治療宮頸癌的藥物。