m6A去甲基化酶FTO通過調控p53磷酸化抑制急性髓系白血病的發生發展

華春蘭,李海軍,喻靜

(鄭州大學第一附屬醫院 河南省檢驗醫學重點實驗室,河南 鄭州 450052)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是血液系統的惡性腫瘤,發病率高,預后差。m6A甲基化是20世紀70年代被發現的一種RNA分子上的甲基化修飾,存在于各種RNA中,但主要在mRNA中出現[1]。它主要是通過影響mRNA與讀取蛋白的結合,從而調控mRNA的可變剪接、翻譯效率和穩定性等,進而改變基因表達[2]。在細胞癌變的過程中,m6A甲基化這一表觀遺傳修飾能通過調控癌基因、抑癌基因的mRNA分子的表達水平來影響腫瘤的發生發展。FTO是m6A的去甲基酶,其主要生理功能為調節機體的代謝速率、能量平衡、體重及體脂聚集。有研究報道FTO基因非編碼區域的多個SNPS與乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤的患病風險有關[3-4]。FTO通過對下游靶基因RNA m6A進行去甲基化修飾,調控下游靶基因的表達,從而促進AML、肺癌以及消化系統腫瘤的發生發展。此外,研究證明,在混合譜系白血病重排的AML細胞系中轉染FTO基因后,AML細胞的生長及增殖能力增強,凋亡減少,同時細胞中mRNA m6A水平下降;而轉染突變體FTO基因(去甲基化功能喪失)后,AML細胞則無上述改變,說明FTO在調控AML發生發展中起重要作用[5-7],但FTO通過何種機制調控AML的發生發展并不清楚。因此,進一步研究FTO調控AML發生發展的機制,突破常規,為AML的分子病理診斷和分子靶向治療探尋新方向,才可能改變治療現狀,為患者提供更有效的治療手段。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

293T細胞、K562細胞和HL60細胞為本實驗室保存。臨床材料取自鄭州大學第一附屬醫院2018年1月至2019年1月的27例AML患者和15例健康對照者骨髓。本研究經醫院倫理委員會討論通過,編號為ZZU-LAC20230331[09]。所有患者均簽署知情同意書。流式相關抗體CD45-Percp、p-p53-FITC(Alexa Fluor 488)購自e-Bioscience。凋亡相關試劑:Annexin Ⅴ-PE/7-AAD apoptosis Kit FITC、IntraSure kit均為美國BD公司產品。逆轉錄試劑盒購自美國Transgene公司。Fast Start Universal SYBR Green Master購自瑞士Roche公司。PBS、RPMI1640培養基、Gibico胎牛血清購自美國Gibico公司。普通PCR儀為美國ABI公司產品;LSRⅡ流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2 PCR檢測白血病患者及健康對照者外周血中FTO表達情況

采用熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)法。利用Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒提取AML患者和健康對照者標本總RNA,利用全式金反轉錄試劑盒,用Oligo(dT)18,2×TS Reaction Mix,TransScript RT/RI Enzyme混合物以RNA為模板,逆轉錄合成cDNA。根據熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR分析。PCR反應體系:10 μL SYBR Green,3 μL模板,10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL,去離子水5 μL。PCR反應條件:95 ℃、10 min;95 ℃、15 s),60 ℃、60 s,45個循環;每個標本3復孔,按照上述條件進行擴增,使用2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。FTO引物序列:前向5’-ACTTGGCTCCCTTATCTGACC-3’,反向5’-TGTGCAGTGTGAGAAAGGCTT-3’。GAPDH引物序列:前向5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.3 細胞轉染

FTO-siRNA購自Invitrogen公司,共2個FTO-siRNA(簡稱為hFTO-siRNA1、hFTO-siRNA2)、1個hFTO-siNC。按照慢病毒包裝試劑盒說明書轉染293T細胞并收集富含慢病毒顆粒的上清液。將細胞(每孔5×105)接種至6孔板中,保證細胞在孔中均勻分布。將慢病毒轉染液和陰性對照分別加入相應培養孔中,置37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續進行培養。約6 h后去除轉染混合液,更換為新鮮培養基,之后將培養板置于培養箱中培養48 h。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞凋亡檢測使用Anncxin V-PE/7-AAD試劑盒(BD公司)。每管樣品(50 μL)細胞數為5×105個,依次加入Annexin V-PE(5 μL)及7-AAD(5 μL),混勻后室溫避光孵育15 min。再加入400 μL的Binding buffer 重懸并過膜,1 h之內上機檢測。

1.5 流式細胞儀檢測細胞內磷酸化

細胞內磷酸化檢測使用BD公司檢測試劑盒,每管樣品(50 μL)細胞數為1×107個。樣品管按照檢測項目分別加入相應的抗體,冰上孵育30 min。每管加入100 μL試劑A,混勻并室溫避光放置5 min。每管加入1 mL固定裂紅液,室溫避光孵育10 min后2 000 r·min-1離心8 min并棄上清,留約50 μL液體。每管加入50 μL試劑B及p53s46抗體,室溫孵育1 h,每管用1 mL PBS洗1遍,2 000 r·min-1離心(Eppendorf 5810離心機,半徑30.5 cm)8 min并棄上清,重懸至300 μL,上機檢測。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 FTO在AML中高表達

本研究對27例人AML骨髓標本和15例正常骨髓標本中FTO基因表達進行RT-PCR檢測,結果顯示在人AML骨髓細胞中,FTO的表達水平高于健康對照者(圖1A)。利用生物信息學方法對TCGA數據庫進行分析,結果顯示在白血病中FTO表達水平與健康對照者相比升高(圖1B);FTO高表達組總體生存率約為100個月,較FTO低表達組(總體生存率約為200個月)低(P<0.01)(圖1C);Pearson相關性分析顯示FTO與p53之間存在相關性(P<0.001)(圖1D)。

A為FTO在人AML中的表達;B為TCGA數據庫中FTO的表達水平;C為FTO的表達與生存率;D為FTO與p53之間的相關性;*為P<0.05;**為P<0.01。

2.2 FTO表達降低后促進白血病細胞的凋亡

為了檢測FTO表達降低后HL60和K562細胞的細胞凋亡情況,首先用FTO的siRNA對FTO進行敲降,使FTO表達降低,敲降效率見表1;接著使用流式的方法通過Annexin V和7-AAD標記檢測HL60和K562細胞的凋亡情況,其中Annexin V陽性細胞為凋亡細胞,Annexin V陰性細胞為活細胞,結果顯示FTO表達降低后白血病細胞的凋亡增加,見圖2、表2。

表1 FTO-siRNA的敲降效率

表2 不同處理組HL60和K562細胞發生凋亡比率

2.3 FTO表達降低后p53磷酸化水平升高

生物信息學分析顯示FTO與p53存在相關性,并且在細胞系中FTO表達降低后白血病細胞凋亡增多,為了探討白血病細胞凋亡是否與p53的磷酸化有關,采用流式方法檢測p53的磷酸化水平,發現FTO表達降低后p53磷酸化水平升高,見圖3、表3。

表3 p53磷酸化平均熒光強度

A為FTO表達降低后HL60細胞中p53磷酸化水平;B為FTO表達降低后K562細胞中p53磷酸化水平。

3 討論

隨著免疫學、細胞遺傳學和分子生物學等技術的應用,有研究認為白血病的發生可能是細胞遺傳學和表觀遺傳學共同作用的結果。人類AML細胞具有獨特的基因表達譜,在AML細胞中的許多突變基因都編碼具有表觀遺傳調控或修飾功能的蛋白質分子,如DNMT3A、TET2、IDH、EZH2、KMT2A和KDM5A等,提示表觀遺傳修飾的改變是AML發生的重要機制[8-9]。

RNA m6A甲基化于20世紀70年代被發現,是一種最常見的甲基化修飾,其由一系列甲基轉移酶(METTL3/14、WTAP、RBM15/15B、KIAA1429,即m6A編碼器)、去甲基酶(FTO和ALKBH5,即m6A消碼器)和識別碼(YTHDF1/2/3、YTHDC1、 HNRNPA2B1、 HNRNPC、eIF3、FMR1、LRPPRC,即m6A讀碼器)協調的動態可逆過程[10-11]。FTO是m6A的去甲基酶,屬于AlkB家族高度同源蛋白,表達于細胞核[12]。2007年Frayling等[13]在研究與肥胖發生相關基因時首次命名,然后迅速成為各科研領域研究的熱點。Pitman等[14]發現敲除FTO基因后神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y細胞中ATP水平顯著增高,而磷酸化的AMP蛋白激酶和蛋白激酶B表達下降,這提示FTO基因敲除可導致腫瘤細胞內能量平衡的破壞。Zhang等[15]研究發現,雌激素可通過PI3K-Akt和絲裂素活化蛋白激酶信號通路對FTO基因進行調控,敲除FTO基因可明顯抑制子宮內膜癌細胞株的增殖活性。Liu等[16]發現FTO蛋白可通過降低其靶基因ASB2、RARA等mRNA中m6A水平,促進這些基因表達,從而促進AML的發生,同時研究還發現FTO可抑制全反式維甲酸誘導的白血病細胞向粒細胞和單核細胞的分化。Su等[17]發現用羥戊二酸抑制FTO的去甲基化酶活性,可促進MYC和CEBPA轉錄本中m6A水平,抑制AML的發生發展。這些研究使FTO基因成為一種新興的腫瘤治療靶點。本研究顯示在人AML細胞中,FTO的表達水平高于正常細胞。另外,通過基因生物信息學的方法比較白血病患者與健康者樣本中FTO的表達水平,發現白血病患者中FTO表達水平升高;分析白血病患者總體生存率發現,FTO高表達組患者的總體生存率約為100個月,FTO低表達組患者的總體生存率約為200個月,FTO高表達組患者的總體生存率低于FTO低表達組。在細胞系HL60和K562中,利用FTO-siRNA將FTO進行敲降使其表達降低后,發現HL60和K562細胞的凋亡增加,表明FTO表達降低后可促進白血病細胞的凋亡。以上結果表明FTO在白血病發生發展過程中發揮著重要的作用。

p53是定位于細胞核的一種抑癌因子,在抑制腫瘤的發生進展和轉移等方面起著重要的作用,其編碼基因定位于人染色體17p13上,全長20 kb,共編碼393個氨基酸[18]。p53蛋白從氨基端到羧基端包括2個轉錄激活結構域、1個富含脯氨酸的結構域、1個DNA結合結構域、1個四聚體寡聚化結構域和1個調節結構域[19]。當細胞接受DNA損傷、活性氧及缺氧等信號刺激時,p53蛋白會發生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等修飾,活化并激活下游信號通路,通過阻滯細胞周期、修復DNA損傷、激活細胞凋亡及自噬等多種機制抑制腫瘤形成[20]。有研究證實MDM2可以通過抑制p53與p300的結合,降低p53的乙酰化水平進而降低p53的轉錄活性,形成p53-MDM2負反饋調節通路,以此來調控腫瘤細胞的凋亡[21-22]。另外有研究顯示,p53還在心血管疾病中起著重要的作用,p53失活后可以加速動脈粥樣硬化的進展[23]。本研究首先利用生物信息學分析的方法,通過Pearson相關系數和P值發現FTO與p53之間存在相關性,并且FTO表達降低后白血病細胞的凋亡增加,為了驗證FTO敲降后p53的變化,采用流式方法檢測了p53的磷酸化水平,發現在細胞系HL60和K562中,FTO表達降低后p53磷酸化平均熒光強度增加,表明FTO表達降低后p53磷酸化水平升高。

4 結論

在AML中FTO表達升高,FTO表達降低可使p53磷酸化水平升高,FTO可以通過調控p53磷酸化,抑制AML的發生發展,這可以為AML的診療尋找新的靶點并提供理論依據。