電針對神經根型頸椎病大鼠神經損傷的膠原纖維、TGF-β、TNF-α的影響

邱怡婕 楊盼 胡柯 楊和淦 黃長軍

摘要： 目的 ?研究電針干預神經根型頸椎病神經損傷的作用機制。 方法 ?選用72只雌性Wistar大鼠，隨機分為空白對照組，假手術組，模型組，電針組，每組18只；建立神經根型頸椎病模型后，造模第3 d開始電針刺激大鼠的雙側的天柱、頸百勞、大杼穴，隔天1次，每次20 min；造模后第4周，檢測大鼠的痛閾后并取頸部脊髓組織； 石蠟切片，Masson染色脊髓組織檢測膠原纖維；免疫組化檢測頸部脊髓組織的TGF-β、TNF-α的蛋白表達水平；qPCR檢測脊髓組織中TGF-β、TNF-α的mRNA表達水平。 結果 ?①痛閾檢測結果：與空白組比較，假手術組的差異不具備統計學意義（ P >0.05）；模型組與假手術組比較，大鼠的痛閾值明顯下降，電針組與模型組比較，大鼠痛閾值顯著提高（ P <0.05）。②Masson染色后，與空白組對照組相比，假手術組膠原纖維未見明顯變化（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組膠原纖維明顯增加（ P <0.05）；與模型組相比，電針組膠原纖維明顯減少（ P <0.05）。③免疫組化檢測結果，與空白對照組比較，假手術組TGF-β、TNF-α蛋白未見明顯變化（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組TGF-β、TNF-α蛋白明顯增加（ P <0.05）；與模型組相比，電針組TGF-β、TNF-α蛋白明顯減少（ P <0.05）。④qPCR檢測結果，空白對照組與假手術組相比，差異沒有統計學意義（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組TNF-αmRNA、TGF-β1mRNA表達水平均顯著上升（ P <0.05）；與模型組相比，電針組TNF-αmRNA、TGF-β1mRNA表達水平明顯降低（ P <0.05）。 結論 ?電針治療神經根型頸椎病大鼠模型，通過下調頸髓組織中TGF-β、TNF-α蛋白及mRNA表達水平，提高神經根型頸椎病大鼠的痛閾值并降低膠原纖維的含量，減少神經外瘢痕組織的增生，從而減輕神經的炎性損傷及促進神經損傷的修復。

關鍵詞： ?神經根型頸椎病；電針；神經炎癥；瘢痕增生；神經修復

中圖分類號 ：R246 ???文獻標志碼 ：A ???文章編號 ：1007-2349（2023）08-0082-07

Effects of Electroacupuncture on Collagen Fibers， TGF-β and TNF-α Induced ?by Nerve Injury in Rats with Radiculotic Cervical Spondylosis

QIU Yi-jien1， YANG Pann1， HU Ken1， YANG He-gan1， HUANG Chang-jun ?1， 2

（1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China; ?2. The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China）

【Abstract】 Objective： To study the mechanism of electrioacupuncture intervention on nerve injury in cervical radiculopathy. Methods： 72 female Wistar rats were randomly divided into blank control group， sham operation group， model group and electroacupuncture group， 18 rats each group. After establishing the cervical spondylosis model of nerve root type， on the 3rd day of modeling， the rats' bilateral Tianzhu， Jingbailao and Dashu points were stimulated by electroacupuncture， once every other day for 20 min each time. At the 4th week after modeling， the rats' pain threshold was detected and their cervical spinal cord tissues were taken. Paraffin sections were obtained， and collagen fibers were detected by Masson staining of spinal cord. The protein expression levels of TGF-β and TNF-α were detected by immunohistochemistry. The mRNA expression levels of TGF-β and TNF-α in the spinal cord were detected by qPCR. Results： 1. The results of pain threshold detection： Compared with the blank group， the difference of the sham operation group was not statistically significant （ P >0.05）. Compared with that of the sham operation group， the pain threshold of rats of the model group was significantly decreased， and the pain threshold of rats of the electroacupuncture group was ?significantly increased （ P <0.05）. 2. After Masson staining， there was no significant change in collagen fibers of the sham operation group compared with that of the blank control group （ P >0.05）; Compared with that of the sham operation group， the collagen fibers of the model group were significantly increased （ P <0.05）. Compared with that the model group， the collagen fibers of the electroacupuncture group were significantly reduced （ P <0.05）. 3. Compared with that of the blank control group， the TGF-β and TNF-α proteins of the sham operation group had no significant changes （ P >0.05）. Compared with that of the sham operation group， the TGF-β and TNF-α proteins of the model group were significantly increased （ P <0.05）. Compared with that of the model group， the TGF-β and TNF-α proteins of the electroacupuncture group were significantly decreased （ P <0.05）. ④ There was no significant difference in qPCR results between the blank control group and the sham operation group （ P >0.05）. Compared with that of the sham operation group， the expression levels of TNF-αmRNA and TGF-β1mRNA of the model group were significantly increased （ P <0.05）. Compared with that of the model group， the expression levels of TNF-αmRNA and TGF-β1mRNA of the electroacupuncture group were significantly decreased （ P <0.05）. Conclusion： Electroacupuncture can reduce the expression levels of TGF-β and TNF-α protein and mRNA in cervical spinal cord tissue， increase the pain threshold of CSR rats， reduce the content of collagen fibers， and reduce the hyperplasia of extraneuronal scar tissue， so as to alleviate the inflammatory injury of nerves and promote the repair of nerve injury.

【Key words】 Cervical Radiculopathy; Electrioacupuncture; Neuroinflammation; Scar Hyperplasia; Nerve Repair

神經根型頸椎病（CSR）占頸椎病患病人群的 60%～70% ?［1］，其主要臨床表現為頸神經根放射性疼痛、麻木無力等，其發病可能與相應節段背根神經節受到物理機械壓迫和化學炎癥刺激，以致發生慢性損傷有關。機體在慢性損傷的自我修復過程中，會出現瘢痕組織，瘢痕屬于自然產物。但是，在神經的再生過程中，瘢痕會阻礙近端軸突向遠端生長，影響神經損傷的修復 ?［2］。目前，電針治療CSR的臨床療效顯著 ?［3-5］，但電針治療CSR神經損傷的作用機制研究缺乏。本實驗旨在通過研究神經外瘢痕形成與炎癥細胞因子如轉化因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）產生之間的關系，探討電針干預神經根型頸椎病神經損傷的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 動物 Wistar大鼠（斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2019-0010）72只， 180-220g，雌性，普通飼料飼養于溫度20～26℃，濕度 40%～70%）環境中。

1.3 主要試劑 二甲苯（33535，西隴科學股份有限公司），無水乙醇（32061，西隴科學股份有限公司），Masson三色染色液（G1006，Servicebio），中性樹脂膠（CW0136，CWBIO），TGF-β（AF1027，AFFINITY）， TNF-α（AF7014，AFFINITY），辣根酶標記山羊抗兔IgG （H+L）（ZB-2305，中杉金橋）；DAB顯色試劑盒（CW0125，CWBIO）；中性樹脂（CW0136，CWBIO）；蘇木素染色（AR1180-1，博生德生物）。TrizonReagent（CW0580S，CWBIO）；超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO）；HiScriptIIQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）（R223-01，Vazyme）；ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix（Q711-02，Vazyme）。

1.4 主要儀器 組織脫水機（KD-TS3S1，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司），石蠟包埋機（HistoCore Arcadia，Leica），切片機（HistoCore BIOCUT，Leica），顯微鏡（BX43，OLYMPUS）。紫外分光光度儀（NP80，NanoPhotometer）；熒光PCR儀（CFXConnect ?TM實時，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司）；超高靈敏度化學發光成像系統儀（ChemiDocTMXRS+，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司）；華佗牌一次性不銹鋼毫針 （0.35 mm×13 mm），華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）。

2 方法

2.1 實驗分組 實驗分為空白對照組（Blank control group） （ n =18）、假手術組（Sham operation group） （ n =18）；模型組（Model group）（ n =18）；電針組（Electric needle group）（ n =18）。

2.2 動物模型構建 動物適應性飼養7 d后，將模型組、電針組大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉 （30 mg/kg）后，常規頸背部進行備皮，碘伏消毒造模部位，鋪巾，以第二胸椎棘突為標記，以頸七為中心，沿棘突縱行切開皮膚及皮下組織，切口約3.5 cm，鈍性分離棘突兩側的肌肉，暴露棘突及兩側椎板，咬除頸6、7棘突、椎板，暴露出椎管內的脊髓，用神經剝離子鑷將脊髓往一側推，顯露出左側頸6、7神經根，將浸有5%福爾馬林的定量濾紙放在左側頸6、7神經根腋下。按壓止血，逐層縫合。假手術組重復上述操作，但不放入浸有5%福爾馬林的定量濾紙。

2.3 干預方式

2.3.1 空白對照組 正常飼養，不做其他任何干預。

2.3.2 假手術組 正常飼養，造模后第3 d開始，同電針組做捆綁干預，隔天1次，每次20 min，總共干預13 d。

2.3.3 模型組 正常飼養，造模后第3 d開始，同電針組做捆綁干預，隔天1次，每次20 min，總共干預13次。

2.3.4 電針組 正常飼養，造模后第3 d開始進行電針干預，連續波，頻率15 Hz，強度以大鼠胡須抖動但不出現掙扎為度，隔天1次，每次20 min。針刺的穴位選大鼠雙側的天柱、頸百勞、大杼穴三穴，總共干預13次。

2.4 造模評分及痛閾檢測 參照文獻 ?［6］方法，造模第2天起，每日上午9∶ 00-10∶ 30將大鼠置于觀察箱，適應周圍環境30 min后，觀察（1h）有無自噬、舔叫、嘶叫等行為；對其由疼痛反應足爪攣縮造成的步態障礙進行評估；按照參考文獻方法 ?［7］，造模后第4w，檢測四組大鼠的痛閾值。采用YLS-3E疼痛分析儀分別檢測三組大鼠的機械痛閾：將疼痛分析儀的鈍頭有機玻璃裝置放置于大鼠的足趾第三、第四跖骨中間，緩慢增加壓力，直至大鼠出現嘶叫、掙扎、試圖抽回足爪，記錄此時疼痛分析儀的壓力值（g）即為大鼠的機械痛閾。

2.5 Masson染色 造模后第4 w，取頸部脊髓組織樣本，流水沖洗數小時，經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯 Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明為止）。放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各 50～60 min。石蠟包埋，切片。切片常規脫蠟至水，用配制好的Weigert鐵蘇木素染色液染色10 min，酸性乙醇分化5～15 s，稍水洗；Masson藍化液返藍 5 min，予蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色 8 min；在上述操作過程中按蒸餾水2∶ 弱酸溶液= 2∶ 1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸溶液洗2 min；用配置好的弱酸工作液洗1 min；直接放入苯胺藍染色液中染色2 min；用配置好的弱酸工作液洗1 min；95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s，超凈高級封片膠封片。

2.6 免疫組化檢測 采用免疫組化檢測TGF-β和TNF-α表達情況。造模后第4w，取頸部脊髓組織切片烤片、脫蠟、水化后，用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。經5%BSA抗原封閉后，用TGF-β（1∶ 200）和TNF-α（1∶ 200）進行一抗孵育，4℃過夜后，進行辣根過氧化物酶標記的IgG（H+L）（12∶ 100）孵育，經DAB顯色，蘇木精復染反藍，脫水透明后，封片，在顯微鏡（BX43，Olympus）下進行觀察。

2.7 qPCR檢測 采用Trizon試劑提取頸部脊髓組織中的總RNA，采用RNA超純提取試劑盒提取mRNA，利用紫外可見分光光度計測定mRNA的濃度和純（OD260/OD280），通過RNA逆轉錄試劑盒逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應步驟如下：預變性95 ℃，10 min；變性 95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72℃，30 s；41個循環。引物序列如下表所示。

2.8 統計學方法 應用SPSS 25.0軟件進行統計分析。定量結果采用均數±標準差（ x ±s ）表示。多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用TUKEY法，以 P <0.05為差異具有統計學意義的標準。采用Graphpad Prism 9軟件繪制qPCR數據圖。

3 實驗結果

3.1 電針對CSR大鼠的痛閾檢測結果 詳見表2。

3.2 電針對CSR大鼠頸部脊髓組織中膠原纖維的Masson染色結果 圖1結果顯示，Masson染色后膠原纖維呈藍色。與空白組對照組相比，假手術組膠原纖維未見明顯變化（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組膠原纖維明顯增加（ P <0.05）；與模型組相比，電針組膠原纖維明顯減少（ P <0.05）。

3.3 電針對CSR大鼠頸部脊髓組織TNF-α蛋白、TGF-β蛋白的免疫組化結果 免疫組化結果顯示， 圖2中，與空白對照組相比，假手術組中TNF-α蛋白水平未見明顯改變（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組TNF-α蛋白水平明顯提高（ P <0.05）；與模型組相比，電針組TNF-α蛋白水平明顯降低（ P <0.05）。

圖3結果顯示，與空白對照組相比，假手術組中TGF-β蛋白水平未見明顯變化（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組TGF-β蛋白水平明顯提高（ P <0.05）；與模型組相比，電針組TGF-β蛋白水平明顯降低（ P <0.05）。

3.4 電針對CSR大鼠頸部脊髓組織TNF-α、TGF-β的qPCR檢測結果 圖4結果顯示，與空白對照組相比，假手術組中TNF-αmRNA表達水平未見明顯變化，差異不具有統計學意義（ P >0.05）；與假手術組相比，模型組TNF-αmRNA表達水平明顯提高 （ P <0.05）；與模型組相比，電針組TNF-αmRNA表達水平明顯降低（ P <0.05）。

圖4結果顯示，與空白對照組相比，假手術組中TGF-β1mRNA表達水平沒有明顯變化，差異不具有統計學意義（ P >0.05）；與假手術相比，模型組 TGF-β1mRNA表達水平顯著提高（ P <0.05）；與模型組相比，電針組 TGF-β1mRNA表達水平明顯降低 （ P <0.05）。

4 討論

現代醫學認為CSR的發病多與神經根機械性壓迫與炎性刺激有關 ?［8］。神經根的炎癥導致神經損傷是該病的病理基礎，進而導致神經根型疼痛的發生。中醫學將CSR歸于痹證類病范疇。《素問·痹論》：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。”痹證多因風寒濕三邪客于經絡，導致筋脈拘攣，氣血不通，不通則痛。針刺具有疏通經絡的作用，可以達到“通則不痛”的效果。臨床上針刺治療CSR已經相當普及且療效顯著 ?［9-11］，而電針是在毫針的基礎上，以一定的電流刺激代替手法操作，具有針刺和電療的雙重效果。有研究表明電針治療CSR可以減輕炎癥反應，降低炎癥因子的表達 ?［12-14］。本實驗旨在觀察電針雙側大杼穴、天柱、頸百勞穴對CSR大鼠模型的頸髓及神經組織中炎性細胞因子TGF-β、TNF-α表達情況與神經外瘢痕形成之間的影響。

本實驗所選大杼穴、天柱、頸百勞穴均位于頸項部，頸項部是CSR的好發部位，是聯系全身臟腑經絡的樞紐，其中手足三陽經、足三陰經、任督二脈等直接循行，此處病變會使局部氣血循行受阻，不能榮養頸椎，可導致椎間盤變性，頸椎失穩，關節錯縫，刺激神經根而引起該病 ?［15］。而大杼為八會穴之骨會，又為手足太陽經交會穴，刺之可調節太陽經氣和治療全身骨骼病變。天柱穴屬于足太陽膀胱經，位于頸椎上端，如《百癥賦》云：“項強多惡風，束骨相連于天柱”，針刺天柱穴具有通經活絡之功。頸百勞屬于經外奇穴，在《針灸孔穴及其療法便覽》中有描述：“百勞，奇穴，大椎穴上二寸，外開一寸處。針三至五分，灸三至七壯……亦治項肌痙攣或扭傷回顧不能”，該穴可治療頸項部經筋病變 ?［16-18］。此外，本實驗采取低頻連續波可引起肌肉舒縮，產生較強的震顫感，提高肌肉韌帶張力，調節血管的收縮舒張功能，改善血液循環，促進神經肌肉功能的恢復 ?［19］。兩者相結合，治療CSR的效果顯著。

本實驗在造模后，電針組與模型組相比，大鼠痛閾值顯著提高（ P <0.05）。此結果與現代研究的結果一致 ?［6，8］，但其中作用機制尚不清楚，根據本實驗免疫組化的結果所示，經電針治療后，TNF-α、TGF-β 蛋白水平明顯降低（ P <0.05）。這提示CSR大鼠痛閾值的提高可能與TNF-α、TGF-β蛋白水平相關。同時根據qPCR結果顯示，經電針干預后， ?TNF-αmRNA、 TGF-β1mRNA表達水平明顯降低 （ P <0.05）。這提示TNF-αmRNA、TGF-β1mRNA表達水平也會影響著大鼠痛閾值。這與現代學者思想相符合，他們認為大鼠痛閾值與減少各類神經炎癥介質如TNF-α、TGF-β的合成和分泌有關 ?［13，20］。TNF-α是主要由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎細胞因子，參與機體的免疫反應、應激反應和炎癥調節 ?［21］，可刺激炎性細胞聚集和誘導炎性細胞因子的釋放，進而介導炎癥反應 ?［22］。除了機械壓迫的因素外，TNF-α也是啟動和維持神經痛狀態的關鍵性病理因素 ?［23］。TNF-α作用于軸突產生的異常的電生理活動及造成的沃勒變性（神經纖維的脂肪變性）可能在神經根性痛中起著很重要的作用 ?［24］。有研究表明，TNF-α水平的增高，使局部組織中血管內皮細胞受損，引起頸椎骨代謝異常，這可能是導致頸椎退變逐漸加重的生物學機制之一 ?［25］。而 TGF-β1屬于 TGF-β家族，是趨化因子家族成員，可誘導、趨化炎癥細胞向頸椎間盤周圍聚集，加重組織炎性損傷 ?［26］，而炎癥的加重會導致CSR的根型疼痛癥狀明顯。在一項臨床研究中，針刺CSR患者可明顯降低神經根型頸椎病患者血清TGF-β1的表達，減輕CSR疼痛程度，改善頸椎功能 ?［13］。

現代研究證實神經根受到持續性的機械性壓迫時，周圍神經的正常結構會被破壞，導致局部炎性細胞聚集及肉芽組織增生，進而形成瘢痕組織 ?［27］。瘢痕組織過度增生，會影響神經軸突的再生，妨礙神經功能的修復 ?［2］。而瘢痕形成受組織中TNF-α、 TGF-β1的影響 ?［28-29］。瘢痕組織形成的主體細胞是成纖維細胞，其產生大量的膠原纖維，在細胞外基質中增殖 ?［30］。根據Masson染色結果顯示，經電針治療后，與模型組相比，電針組膠原纖維明顯減少（ P <0.05）。膠原纖維難以被機體吸收，導致大量堆積，形成瘢痕組織。同樣膠原纖維的合成與降解是一個動態的、復雜的過程，需要各種相關蛋白酶的參與。有研究證實TNF-α在成纖維細胞膠原合成與分解代謝發揮著重要作用 ?［31］，TNF-α具有雙向調節成纖維細胞功能，高濃度時可促纖維細胞處于增殖狀態，而低濃度時能有效抑制細胞增殖，其雙向調節機制可能與 TNF-αR1作用成纖維細胞時介導的信號轉導途徑不同有關 ?［32］。有學者證實增生性瘢痕組織中 TNF-αR1 mRNA表達低于正常瘢痕組織，同時隨著時間增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表達會顯著上升 ?［33］。同樣，有最新研究表明TGF-β可以激活成纖維細胞，使其不斷地增生，還抑制細胞外基質降解，并促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，導致基質過度沉積，瘢痕過度增生 ?［34］。亦有學者證明 TGF-β通過上調Sar1a表達，并誘導增生性瘢痕成纖維細胞中的前膠原-I分泌，導致膠原纖維不斷增殖 ?［35］。

綜上所述，電針通過下調頸髓組織中TGF-β、TNF-α的蛋白及mRNA表達水平，提高大鼠的痛閾值并降低膠原纖維的含量，減少神經外瘢痕組織的增生，從而減輕神經的炎性損傷及促進神經損傷的修復。

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（收稿日期：2022-12-20）