hsa-miR-146a-5p的靶基因預測及生物信息學分析*

李珍珍 張 瑞 劉 霜 伍 磊 朱廳廳 李 兵

貴州大學醫學院,貴州省貴陽市 550025

microRNA (miRNA) 是一類高度保守的非編碼小分子RNA,越來越多的證據表明,miRNA參與了多種疾病的發生發展過程[1]。miRNA可以通過轉錄后降解或翻譯抑制來調節靶基因表達,主要通過RNA誘導直接降解靶miRNA分子來調控靶基因miRNA的轉錄,或通過堿基互補配對與靶基因miRNA的3’末端非翻譯區(3’-untranslatedregion,3’-UTR) 結合來抑制其翻譯表達等方式起調控作用[2]。hsa-miR-146a-5p位于第5號染色體的LOC28628基因中的第二個外顯子區。既往研究表明,在多種腫瘤與炎癥的發病機制過程中,hsa-miR-146a-5p可能發揮著重要作用[3-4]。本研究擬通過運用生物信息學技術預測hsa-miR-146a-5p的相關靶基因,獲取其關鍵節點靶基因,探索hsa-miR-146a-5p在腫瘤及炎癥中發揮的作用,以期為探索hsa-miR-146a-5p在腫瘤和炎癥中相關分子功能及作為臨床診斷提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-146a-5p的保守性分析 利用UCSC (http://genome.ucsc.edu/)、miRBase (http://www.mirbase.org) 等在線數據庫獲取hsa-miR-146a-5p的染色體定位、堿基序列、物種保守性等基礎信息。使用在線數據庫miR-Gator (http://mirgator.kobic.re.kr) 獲取hsa-miR-146a-5p在不同人類疾病中的表達豐度。

1.2 hsa-miR-146a-5p的靶基因預測 通過mirDIP (http://ophid.utoronto.ca/)、TargetScan (http://www.targetscan.org)和miRDB (http://mirdb.org) 三種在線數據庫預測hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因。利用Venny在線軟件取交集。再利用miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) 數據庫獲取已經過實驗驗證的hsa-miR-146a-5p的靶基因,將預測得到的潛在靶基因和實驗證實的靶基因進行合并,最終得到hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因用于進行后續的分析研究。

1.3 hsa-miR-146a-5p的靶基因蛋白質互作網絡(PPI)分析 利用在線數據庫String(https://string-db.org)得到所預測靶基因集合編碼蛋白質之間的相互關系網絡數據,然后將所得數據整理格式后導入Cytoscape 3.9.0軟件進行PPI分析。

1.4 hsa-miR-146a-5p的靶基因KEGG信號通路分析及GO功能注釋 將前期預測得到的靶基因及其分析數據導入在線數據庫DAVID (https://david.ncifcrf.gov) 對靶基因數據進行KEGG信號轉導通路富集分析和GO分析,以P<0.05作為差異有統計學意義的標準,獲取有差異的GO生物學過程及KEGG信號通路。

2 結果

2.1 各物種成熟miR-146a-5p序列保守性及染色體定位分析 UCSC數據庫查詢結果顯示,hsa-miR-146a-5p的基因序列號為MIMAT0000449,位于5q33.3染色體區域內 (見圖1),利用miRBase數據庫獲取人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、家犬(Canis familiaris)等十個物種的miR-146a-5p成熟序列。通過對比分析發現miR-146a-5p成熟堿基序列中“UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU”22個堿基在各物種間高度保守,結果見表1。

表1 miR-146a-5p在不同物種中的成熟序列

圖1 hsa-miR-146a-5p在人類基因組中的位置

2.2 hsa-miR-146a-5p在人類不同疾病中的表達分析 利用miR-Gator在線數據庫查詢獲得hsa-miR-146a-5p的表達情況:hsa-miR-146a-5p在乳腺侵襲性導管瘤、子宮頸腺鱗癌、急性早幼粒細胞白血病及皮膚腫瘤等疾病中呈現高表達 (見圖2)。

圖2 hsa-miR-146a-5p在人類各組織的表達分析

2.3 hsa-miR-146a-5p靶基因預測 利用mirDIP、miRDB和TargetScan三個在線數據庫得到靶基因個數分別為1 108、488、242個,利用Venny在線軟件取交集得到77個靶基因(見圖3a)。此外,在miRTarBase數據庫中獲取已經過熒光素酶報告實驗、Western blotting以及RT-qPCR等實驗進行驗證的靶基因共80個,其中有7個靶基因與上述交集重合 (圖3b),由此最終得到150個潛在靶基因集合,用于后續生物信息學分析。

圖3 has-miR-146a-5p預測靶基因個數

2.4 hsa-miR-146a-5p靶基因編碼蛋白質間的PPI預測 將前述150個潛在靶基因數據導入到String在線數據庫分析靶基因編碼蛋白質間的相互關系,將分析結果整理格式后導入Cytoscape 3.9.0軟件繪制PPI圖。結果顯示,hsa-miR-146a-5p的靶基因編碼蛋白質之間蛋白質互作關系密切,尤其是TLR4、TRAF6、IL6、NFKB1和EGFR等在整個網絡中處于關鍵節點位置 (見圖4)。

圖4 hsa-miR-146a-5p預測靶基因所編碼蛋白質間的互相作用分析

2.5 hsa-miR-146a-5p的靶基因KEGG分析 對前述150個潛在靶基因進行KEGG富集分析,結果發現,hsa-miR-146a-5p的靶基因顯著富集在Toll樣受體信號通路、乙型肝炎、腫瘤通路、恰加斯病、NF-κB等信號通路、致病性大腸桿菌感染、EB病毒感染、脂質與動脈粥樣硬化、利什曼病、耶爾森菌感染、麻疹、酒精性肝病、弓形蟲病、人巨細胞病毒感染、沙門氏菌感染、人類免疫缺陷病毒1型感染、百日咳、胰腺癌癥、肺結核和TNF信號通路上 (見圖5)。

圖5 hsa-miR-146a-5p預測靶基因KEGG分析結果

2.6 hsa-miR-146a-5p的靶基因GO分析 對前述150個潛在靶基因從生物過程(Biological process,BP)、細胞組分(Cellular component,CC)、分子功能 (Molecular function,MF) 3個方面進行GO分析。結果顯示,這些靶基因主要富集的生物過程包括平滑肌細胞增殖的正調控、MyD88依賴性Toll樣受體信號通路、NF-κB轉錄因子活性的正調節、炎癥反應、白細胞介素介導的信號通路、脂多糖介導的信號通路、DNA模板化的轉錄正調控、I-κB激酶/NF-κB信號傳導的正調節、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和細胞對機械刺激的反應等(見圖6)。主要富集的細胞組分為內體膜、細胞核、細胞溶膠、細胞質核周區、細胞質、細胞表面、核質、高分子復合物、CD95死亡誘導信號復合物和染色質等(見圖7)。主要富集的分子功能為蛋白質結合、DNA結合、同一蛋白結合、轉錄輔壓子活性、NAD+核苷酸酶,環狀ADP核糖生成、NAD(P)+核苷酶活性、鋅離子結合、腫瘤壞死因子受體結合、酶結合和染色質結合等(見圖8)。

圖6 hsa-miR-146a-5p靶基因的生物過程富集分析

圖7 hsa-miR-146a-5p靶基因的細胞組分富集分析

圖8 hsa-miR-146a-5p靶基因的分子功能富集分析

3 討論

近年來大量研究發現,miRNA在各種疾病的發生發展中均起著重要的調控作用,在多種疾病的診斷、治療和預后中發揮了潛在的價值[5]。hsa-miR-146a-5p作為近年來的研究熱點,大量研究表明其與腫瘤及炎癥存在密切關聯[6-8]。目前針對hsa-miR-146a-5p的研究中,涉及的生物學過程、分析功能、信號轉導通路等尚不完全清楚。生物信息學方法能通過針對各種網絡數據庫的獲取,達到快速預測miRNA的潛在靶基因及潛在生物學功能的目的,目前已廣泛運用于基因功能預測研究[9]。本研究通過利用生物信息學的研究方法,對hsa-miR-146a-5p的潛在作用靶點及其相關功能和信號通路進行全面分析。

本次研究首先通過對不同物種hsa-miR-146a-5p的序列對比發現,miR-146a-5p在多個物種中保持高度保守性,該結果表明hsa-miR-146a-5p可能在調控腫瘤和炎癥生物學過程中發揮著重要的作用。接下來,利用目前國內外各種研究中常用的miRNA靶基因預測工具對hsa-miR-146a-5p潛在靶基因進行預測。因miRNA靶基因預測數據庫較多,為了提高預測結果的準確性和可靠性,使用最常用的TargetScan、miRDB、mirDIP數據庫分析hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因,并通過取交集的方式獲取在三大數據庫中均存在的潛在靶基因。同時,也獲取了miRTarBase數據庫已經過熒光素酶報告實驗、Western blotting以及RT-qPCR實驗驗證過的hsa-miR-146a-5p靶基因,二者取并集后,便獲得了無重復的150個潛在靶基因。

本研究通過預測hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因得到其靶基因蛋白質互作網絡的中心節點蛋白質為TLR4、TRAF6、EGFR、NFKBI、IL6,由此推測在hsa-miR-146a-5p調控的生物學效應中上述五個中心節點基因發揮重要作用。其中,對于TLR4、TRAF6和EGFR,目前研究已經通過熒光素酶報告實驗、Western blotting以及RT-qPCR實驗驗證其為hsa-miR-146a-5p直接結合的靶基因。在大鼠腰椎間盤突出癥模型中過表達miR-146a-5p可以降低TLR4信號通路的活性和促炎因子的釋放,這可能是治療腰椎間盤突出癥的潛在策略[10]。在系統性紅斑狼瘡的研究中發現,hsa-miR-146a-5p下調后TRAF6的表達增高,促進狼瘡性腎炎的發生[11]。還有研究表明,隱丹參酮可以通過has-miR-146a-5p/EGFR軸,從而抑制非小細胞癌的增殖[12]。這些研究均表明,hsa-miR-146a-5p很可能通過多靶點的方式在腫瘤和炎癥中發揮著重要的生物學效應。對于NFKB1和IL6,目前國內外尚缺乏相應的研究直接明確證實其為has-miR-146a-5p的直接靶向調控基因,需要后期通過細胞或動物實驗進行證實。

據本次對hsa-miR-146a-5p靶基因的KEGG分析發現,hsa-miR-146a-5p下游靶基因富集的前20條KEGG通路均與腫瘤及炎癥相關。其中,腫瘤相關通路有2條,即腫瘤通路、胰腺癌;炎癥中尤以感染類炎癥最為顯著,感染類炎癥相關通路有14條,即乙型肝炎、EB病毒感染、致病性大腸桿菌感染、利什曼病、鼠疫感染、人巨細胞病毒感染、人類免疫缺陷病毒1型感染、沙門氏菌感染、恰加斯病、麻疹、酒精性肝病、肺結核、百日咳、弓形體病信號通路;其余炎癥相關通路有4條,即Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、TNF信號通路、脂質與動脈粥樣硬化。

在對hsa-miR-146a-5p靶基因的GO富集分析的結果中,前20條生物過程里面有13條與炎癥反應相關,分別是MyD88依賴性Toll樣受體信號通路、NF-κB轉錄因子活性的正調節、炎癥反應、白細胞介素介導的信號通路、脂多糖介導的信號通路、I-κB激酶/NF-κB信號傳導的正調節、細胞對機械刺激的反應、JNK級聯、細胞對缺氧的反應、白細胞介素-6產生的正調節、白細胞介素-8產生的正調節、白細胞黏附血管內皮細胞的正調節、NF-κB誘導激酶活性的激活等。

既往發現hsa-miR-146a-5p在多種腫瘤及炎癥中發揮作用[13]。在腫瘤方面,hsa-miR-146a-5p可以通過靶向TRAF6的3’-UTR抑制胰腺導管腺癌細胞增殖并使其對吉西他濱化療敏感[14]。hsa-miR-146a-5p可抑制結直腸癌細胞增殖,誘導結直腸癌細胞凋亡,抑制細胞遷移,降低p-ERK表達[15]。在炎癥方面,有研究表明源自人臍帶間充質干細胞產生的外泌體中的hsa-miR-146a-5p可以減輕小膠質細胞介導的神經炎癥反應[16]。同時研究證實,骨髓間充質干細胞的外泌體中的miR-146a-5p可通過下調NFAT1和IRAK1的表達,進而減少神經元凋亡以及與抑制小膠質細胞M1極化相關的炎癥,從而在腦出血后提供神經保護和功能改善[17]。hsa-miR-146a-5p還可通過調節TXNIP的表達,抑制骨關節炎軟骨損傷中的細胞增殖,促進細胞凋亡和炎癥反應[18]。研究還表明hsa-miR-146a-5p可能通過抑制TRAF6/NF-κB信號通路影響子癇前期母胎界面的炎癥反應[19]。這些研究和本文結果共同表明,hsa-miR-146a-5p很可能在腫瘤及炎癥的發生發展中起著重要的作用。

綜上所述,本文通過綜合運用生物信息學的方法,預測和分析hsa-miR-146a-5p的物種保守性、hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因、靶基因的蛋白質互作分析、靶基因的KEGG通路富集分析以及GO注釋分析等方面,從而進一步探索hsa-miR-146a-5p在腫瘤、炎癥等中的潛在作用靶點及通路。本研究為將來探索hsa-miR-146a-5p與腫瘤和炎癥發展進程關系提供了初步的理論依據,但本研究所得的結果還需進行體外及體內的實驗研究來進一步證明。