長鏈非編碼RNA NKILA和微小RNA-485-5p在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中的表達研究

裔 靜 康苧心 盧海波 孫相波

南通大學第四附屬醫院耳鼻喉科,江蘇省鹽城市 224000

慢性鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是慢性異質性炎性疾病,根據是否伴有鼻息肉分為慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRS with nasal polyps,CRSwNP)及慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(CRS without nasal polyps,CRSsNP)。CRSwNP發病機制復雜,患者嗅覺減退、鼻塞、流涕、頭痛等癥狀較為嚴重。研究表明,CRSwNP疾病進展與鼻黏膜組織重塑以及持續炎癥浸潤關系密切,持續炎癥刺激可導致氣道細胞外基質產生、降解異常,造成氣道組織改變,進而引發鼻黏膜組織重塑[1]。核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路可調控多種炎癥的進展,誘導促炎基因表達,并向炎癥部位募集細胞因子,且能夠促進CRSwNP鼻黏膜組織重塑過程[2]。當促炎細胞因子聚集時,長鏈非編碼RNA NKILA(long non-coding RNA NKILA,LncRNA NKILA)被NF-κB信號傳導轉錄激活,并能抑制NF-κB的活性[3]。根據以上研究猜測,NKILA可能在CRSwNP疾病進展中發揮作用,但尚未有研究報道。此外,Starbase數據庫在線預測顯示,NKILA與微小RNA-485-5p(microRNA-485-5p,miR-485-5p)存在靶向關系。因此,本研究通過檢測NKILA、miR-485-5p在CRSwNP患者中的表達,探討NKILA、miR-485-5p在CRSwNP發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5月—2022年6月在本院行手術治療的CRS患者93例,并將患者分為CRSwNP組49例(男27例,女22例),CRSsNP組44例(男25例,女19例)。CRS患者納入標準:(1)CRS患者均符合相關診療指南[4];(2)患者均知情同意;(3)均無變應性鼻炎、變應性哮喘等疾病。排除標準:(1)術前1個月內接受過抗菌藥物、糖皮質激素類藥物治療者;(2)妊娠期女性;(3)合并傳染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病者;(4)患有肺囊性纖維化、糖尿病、高血脂、高血壓、冠心病等慢性疾病者。另取同期單純外傷性鼻中隔偏曲患者36例作為對照組(男21例,女15例),均無變應性鼻炎、哮喘等變態反應病史,且近1個月內未使用過抗菌藥物、糖皮質激素類藥物。本研究經醫院倫理委員會審批同意(批件號:2019-012)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集。收集所有受試對象的術前臨床檢查結果(鼻內鏡檢查、鼻竇CT檢查),采用視覺量表評分(VAS)、Lund-Kennedy鼻內鏡評分、Lund-Mackay鼻竇CT評分(CT評分)評估所有受試對象的疾病嚴重程度[4]。

1.2.2 樣本采集。三組均行全身麻醉,由專業耳鼻咽喉頭頸外科醫生行鼻內鏡手術,并于術中取CRSwNP組息肉組織、CRSsNP組鉤突組織及對照組下鼻甲組織。將組織剪成黃豆大小,放入干凈離心管中,液氮速凍,-80℃冰箱保存。

1.2.3 NKILA、miR-485-5p及炎癥因子IL-1β、TNF-α、NF-κB水平檢測。取出組織樣本,研磨成組織勻漿,TRIzol法提取組織總RNA,并逆轉錄成cDNA,miR cDNA采用miRNA cDNA鏈合成試劑盒(ZY130911,上海澤葉生物科技有限公司)合成,NKILA、IL-1β、TNF-α及NF-κB基因cDNA采用逆轉錄試劑盒(205111,德國Qiagen公司)合成。以上述cDNA為模板,配制qRT-PCR反應體系,miR-485-5p內參為U6,NKILA、IL-1β、TNF-α及NF-κB內參為GAPDH(見表1)。于熒光定量PCR儀上檢測組織中NKILA、miR-485-5p、IL-1β、TNF-α及NF-κB的水平。采用2-ΔΔCt法計算NKILA、miR-485-5p、IL-1β、TNF-α及NF-κB相對表達量。

表1 引物序列

1.2.4 生物信息學分析。下載基因表達數據庫(gene expression omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中GSE136825芯片數據,并采用limma包進行差異分析。GSE136825包含6 名患有伴有鼻息肉的CRS受試者和6例不伴有鼻息肉的CRS對照組受試者 ,芯片平臺是Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0,差異結果用火山圖表示,火山圖采用ggplot2包繪制。

2 結果

2.1 NKILA差異分析 通過下載GEO數據庫GSE136825芯片數據,采用R語言limma包進行差異分析,并用ggplot2作圖,繪制差異火山圖,共發現50個差異表達的LncRNA,上調LncRNA 6個,下調LncRNA 44個,其中NKILA顯著上調。見圖1。

圖1 火山圖

2.2 三組基本資料比較 三組年齡、性別及吸煙人數比較,差異無統計學意義(P>0.05);CRSwNP組、CRSsNP組的VAS評分、Lund-Kennedy鼻內鏡評分、CT評分以及NKILA、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平均高于對照組(P<0.05),miR-485-5p水平低于對照組(P<0.05);CRSwNP組VAS評分、Lund-Kennedy鼻內鏡評分、CT評分、NKILA、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平均高于CRSsNP組(P<0.05),miR-485-5p水平低于CRSsNP組(P<0.05)。見表2。

表2 三組基本資料比較

2.3 CRSwNP組患者NKILA、miR-485-5p的相關性分析 Starbase在線預測顯示,NKILA、miR-485-5p存在靶向序列。見圖2。Pearson法分析顯示,CRSwNP組患者息肉組織中NKILA與miR-485-5p呈負相關(r=-0.609,P<0.001)。見圖3。

圖2 NKILA、miR-485-5p靶向關系圖

圖3 CRSwNP組患者NKILA與miR-485-5p的相關性圖

2.4 CRSwNP組患者NKILA、miR-485-5p水平與疾病嚴重程度的相關性 在CRSwNP組中,NKILA水平與VAS評分、Lund-Kennedy鼻內鏡評分及CT評分均呈正相關(P<0.05);miR-485-5p與VAS評分、Endoscopy評分及CT評分均呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 CRSwNP組患者關鍵指標間的相關性分析

2.5 無序多分類Logistics回歸分析CRSwNP的影響因素 因變量為對照、CRSsNP及CRSwNP,分別賦值為0、1、2,以NKILA、miR-485-5p、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平為自變量,無序多分類Logistics回歸分析顯示,與對照組比較,NKILA、NF-κB水平每增加0.1,CRSsNP風險分別增加2.313倍、1.625倍,miR-485-5p水平每增加0.1,CRSsNP風險下降67.4%倍;與CRSsNP患者比較,NKILA、NF-κB水平每增加0.1,CRSwNP風險分別增加2.494倍、1.562倍,miR-485-5p水平每增加0.1,CRSwNP風險下降67.7%。見表4。

表4 影響CRSwNP的無序多分類Logistics回歸分析

2.6 ROC曲線分析NKILA、miR-485-5p水平對CRSwNP的診斷價值 采用ROC曲線分析NKILA、miR-485-5p水平對CRSwNP的診斷價值,結果顯示,在對照組與CRSwNP組之間,NKILA、miR-485-5p診斷CRSwNP的曲線下面積分別為0.966、0.997,見圖4。

圖4 對照組與CRSwNP組NKILA、miR-485-5p水平診斷CRSwNP的ROC曲線

在CRSsNP組與CRSwNP組之間,NKILA、miR-485-5p診斷CRSwNP的曲線下面積分別為0.870、0.954,見圖5。

圖5 CRSsNP組與CRSwNP組NKILA、miR-485-5p水平診斷CRSwNP的ROC曲線

3 討論

CRS是一種慢性復發性炎癥性疾病,其特征在于鼻竇黏膜持續炎癥。當CRS患者暴露于刺激物中時會導致持續炎癥反應,或患者本身存在遺傳易感性,均可促進鼻息肉發生[5]。炎性細胞浸潤是鼻息肉的一種特征,鼻息肉可能造成鼻竇、鼻腔黏膜的破壞[6]。臨床上將CRS分為CRSwNP及CRSsNP兩種,二者表型及發病機制均不同,其中CRSwNP較為難治,且易復發,一項為期12年的隨訪研究顯示,內鏡鼻竇手術后CRSwNP患者的復發率甚至達到78.9%,嚴重影響患者生活質量[7]。

NKILA是一種LncRNA,可調控細胞或組織炎癥反應。楊娟等[8]研究表明,NKILA在LPS誘導的支氣管上皮細胞16HBE中呈低表達,其可通過負調控miR-1236-3p減輕16HBE細胞的炎癥因子水平。本研究對GSE136825芯片進行差異分析,發現NKILA在CRS患者中顯著上調,提示NKILA可能參CRSwNP的發病過程。已有研究證明,CRSwNP與炎癥密切相關。NF-κB是調節細胞炎癥反應和細胞因子表達的重要炎癥調節因子[9],在CRS和鼻息肉組織中均被激活[10]。研究發現,NF-κB可有效地介導人類鼻息肉衍生成纖維細胞(NPDFs)的炎癥變化[11]。提示,NF-κB信號在CRSwNP中可能被激活并調節細胞因子的表達。本研究分析各組炎癥因子IL-1β、TNF-α及NF-κB水平,結果顯示,對照組、CRSsNP組、CRSwNP組IL-1β、TNF-α及NF-κB水平依次升高,兩兩比較差異有統計學意義,與文獻[11]研究一致,CRSwNP患者息肉組織中炎癥因子水平升高。研究顯示,NKILA與NF-κB相互作用,可通過抑制NF-κB調節T細胞對活化誘導細胞死亡的敏感性,此外,NKILA還可通過阻斷IκB磷酸化從而抑制NF-κB介導的癌細胞遷移、凋亡,NKILA與NF-κB信號傳導蛋白相互作用[12]。因此,猜測NKILA可能通過與NF-κB相互作用,參與CRSwNP的疾病進展。本研究結果顯示,CRSwNP組、CRSsNP組、對照組NKILA水平依次降低,且與VAS評分、Endoscopy評分及CT評分均呈正相關,提示NKILA可能參與CRSwNP的發生發展,其機制可能與NF-κB信號通路有關,但還需進一步驗證。

Starbase數據庫顯示,miR-485-5p含有NKILA的互補位點,提示miR-485-5p與NKILA可能存在靶向關系。miR-485-5p可能參與NKILA促進CRSwNP疾病進展的調控過程。miR-485-5p與炎癥有關,Wan等[13]研究顯示,糖尿病腎病患者血清中miRNA-485-5p表達下降,其水平可調節高葡萄糖誘導的炎癥和氧化應激。本研究結果顯示,CRSwNP組、CRSsNP組、對照組miR-485-5p水平依次升高,且與NKILA水平、VAS評分、Endoscopy評分及CT評分均呈負相關,說明miR-485-5p在CRSwNP發生發展中發揮作用,可能與NKILA負調控miR-485-5p有關。

本研究中采用無序多分類Logistics回歸分析影響CRSwNP的因素,NKILA、NF-κB水平升高,CRSwNP患病風險增大,miR-485-5p水平升高,CRSwNP患病風險下降,猜測降低NKILA水平或升高miR-485-5p水平有利于降低CRSwNP的患病風險。此外,ROC曲線顯示,分別分析對照組與CRSwNP組、CRSsNP組與CRSwNP組,NKILA、miR-485-5p水平對CRSwNP的診斷價值均較高,提示可通過檢測NKILA、miR-485-5p水平預測CRSwNP的發生,但是否能廣泛應用于臨床還需進一步探究。

綜上所述,CRSwNP患者息肉組織中NKILA水平升高、miR-485-5p水平下降,二者水平均與CRSwNP患者疾病嚴重程度有關,且對CRSwNP有一定的診斷價值,NKILA可能通過靶向miR-485-5p參與調控CRSwNP的疾病進展。但本研究未進行相關機制研究,仍需通過細胞或動物實驗探究NKILA、miR-485-5p參與CRSwNP發生發展的具體作用機制。