雷帕霉素對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠子宮內(nèi)膜的作用及機(jī)制

許 鑫，楊 君，2，趙金金，吳霏霏，張 瑾，李柯欣

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科,河南 衛(wèi)輝 453100;2.新鄉(xiāng)市婦科惡性腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 衛(wèi)輝 453100; 3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生命科學(xué)研究中心,河南 衛(wèi)輝 453100)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌、生殖障礙性疾病[1]。PCOS往往始于月經(jīng)初潮,可導(dǎo)致月經(jīng)不調(diào)、不孕、高雄激素血癥、肥胖、卵巢多囊改變等[2],遠(yuǎn)期可增加子宮內(nèi)膜癌、心血管疾病、2型糖尿病非依賴性肥胖、代謝綜合征等疾病風(fēng)險(xiǎn)[3]。不孕是PCOS患者突出的臨床問題,其主要原因是卵巢排卵障礙及子宮內(nèi)膜功能異常[4]。有研究表明,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)相關(guān)信號(hào)通路是PCOS的重要病理生理基礎(chǔ),可參與控制細(xì)胞的增殖、生長和代謝等,而雷帕霉素是一種mTOR蛋白特異性抑制劑,可以直接或間接抑制mTOR相關(guān)信號(hào)通路的激活[5-6]。近年來,關(guān)于mTOR相關(guān)信號(hào)通路在PCOS大鼠卵巢病理變化中作用機(jī)制的研究較多,但關(guān)于mTOR相關(guān)信號(hào)通路對(duì)PCOS子宮內(nèi)膜功能障礙的影響及機(jī)制相關(guān)研究較少。基于此,本研究旨在探討雷帕霉素對(duì)PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的作用及機(jī)制,以期為PCOS的基礎(chǔ)與臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)Sprague Dawley雌性大鼠30只,6周齡,體質(zhì)量180～200 g,購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食,飼養(yǎng)溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度40%～60%,每日光照及黑暗時(shí)間各12 h。

1.2 主要試劑與儀器

脫氫表雄酮、雷帕霉素購自上海麥克林生化科技股份有限公司,醫(yī)用大豆油購自浙江田雨山藥用油有限公司,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記測定法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling,TUNEL) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、抗熒光淬滅封片劑、mTOR抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自鄭州賽維爾生物科技有限公司,磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司,磷酸化p70核糖體蛋白S6(phosphorylated-p70 ribosomal protein S6,p-p70S6)抗體購自美國Santa公司;輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司,熒光生物顯微鏡系統(tǒng)購自日本 Nikon公司,BM-IX 生物組織包埋機(jī)、冷凍臺(tái)購自孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及干預(yù)

6周齡雌性大鼠斷乳,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱質(zhì)量,于7周齡時(shí)將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PCOS組、雷帕霉素組,每組10只。PCOS組和雷帕霉素組大鼠經(jīng)頸背部皮下注射脫氫表雄酮(60 mg·kg-1),每日1次,連續(xù)注射28 d;對(duì)照組大鼠每日注射等量生理鹽水。造模成功后,雷帕霉素組大鼠每日腹腔注射雷帕霉素10 mg·kg-1,PCOS組和對(duì)照組大鼠每日腹腔注射等量生理鹽水,連續(xù)注射28 d。

1.3.2 各組大鼠體質(zhì)量檢測

分別于造模前、造模后和給藥28 d后稱各組大鼠體質(zhì)量。

1.3.3 HE染色法觀察大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)變化

給藥28 d后,給予各組大鼠100 g·L-1水合氯醛麻醉,解剖取子宮,分離表面多余組織,生理鹽水沖洗血管。將分離的子宮組織用40 g·L-1多聚甲醛固定,脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋,制備石蠟切片(厚4 μm)。將石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水,蘇木精、伊紅溶液依次染色,常規(guī)脫水、透明后,用中性樹膠封片,晾干后置于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)變化,并拍照。

1.3.4 Masson染色法檢測大鼠子宮內(nèi)膜纖維化

將“1.3.3” 項(xiàng)中制備的子宮組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后進(jìn)行Masson染色,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化情況,子宮內(nèi)膜纖維化分布顯示為藍(lán)色,每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,應(yīng)用Image J軟件分析子宮內(nèi)膜纖維化面積占比。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6的相對(duì)表達(dá)量

將“1.3.3” 項(xiàng)中制備的子宮組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后,浸入枸櫞酸鈉緩沖液中,95 ℃高壓鍋內(nèi)煮沸3 min后,室溫下充分冷卻,滴加體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫,室溫孵育 20 min,滴加山羊血清室溫封閉30 min,滴加mTOR、p-mTOR、p-p70S6一抗(滴度均為1200),4 ℃孵育過夜,滴加二抗(滴度1200),室溫孵育 50 min,滴加二氨基聯(lián)苯胺孵育 10 min,自來水沖洗終止顯色,蘇木精染色1 min,鹽酸乙醇溶液分化,梯度乙醇中脫水,二甲苯溶液透明,滴加中性樹脂封片,置于顯微鏡下觀察并拍照。陽性細(xì)胞被染成棕黃色。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,應(yīng)用 Image J-Pro 軟件分析每個(gè)視野中mTOR、p-mTOR 及p-p70S6的吸光度值,以吸光度值表示各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 TUNEL法檢測大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡

將“1.3.3” 項(xiàng)中制備的子宮組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后,滴加蛋白酶 K于 37 ℃溫箱中孵育 20 min,洗片后滴加 Triton X-100于室溫下孵育 20 min,洗片后滴加反應(yīng)混合液(末端轉(zhuǎn)移酶+脫氧尿嘧啶)避光孵育 2 h,洗片后于二脒基苯基吲哚染液中避光孵育 5 min,沖洗后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片,于熒光顯微鏡下避光觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況,凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)為綠色,每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,以視野下的凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量比較

造模前各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.506,P>0.05)。造模后,PCOS組、雷帕霉素組大鼠的體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PCOS組與雷帕霉素組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥28 d后,PCOS組大鼠的體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組和雷帕霉素組,雷帕霉素組大鼠的體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 3組大鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of body mass of rats among the three groups

2.2 3組大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)變化

給藥28 d后,對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜腺體為多個(gè)腺體簇狀排列,腺腔較大且迂曲較多;PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目較對(duì)照組減少,為單個(gè)腺體分散排列,腺腔小且少有迂曲;雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目較多,呈簇狀排列,但腺腔多小而直,部分可見到一些皺褶和分支,結(jié)果見圖1。

A:對(duì)照組;B:PCOS組;C:雷帕霉素組。圖1 3組大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)變化(HE染色,×200) Fig.1 Pathological changes of endometrium of rats in the three groups (HE staining,×200)

2.3 3組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化情況比較

對(duì)照組、PCOS組、雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積占比分別為(56.0±8.8)%、(77.0±9.4)%、(74.4±8.2)%。3組大鼠的子宮內(nèi)膜纖維的面積占比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.271,P<0.05)。PCOS組和雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積占比顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 PCOS組與雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積占比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果見圖2。

A:對(duì)照組;B:PCOS組;C:雷帕霉素組。圖2 3組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化情況(Masson染色,×200)Fig.2 Endometrial fibrosis of rats in the three groups (Masson staining,×200)

2.4 3組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況比較

對(duì)照組、PCOS組、雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率分別為 (3.582±0.709)%、(6.606±0.844)%、(2.132±0.744)%。3組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=88.390,P<0.05)。PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組和雷帕霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組與雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 3組大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6相對(duì)表達(dá)量比較

PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和雷帕霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜組織中p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組與雷帕霉素組大鼠子宮組織內(nèi)膜組織中mTOR、p-p70S6 的相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果見圖3和表2。

圖3 3組大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×400)Fig.3 Expressions of mTOR,p-mTOR and p-p70S6 in the endometrium of rats in the three groups (immunohistochemical staining,×400)

表2 3組大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6相對(duì)表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of the relative expressions of mTOR,p-mTOR and p-p70S6 in the endometrium of rats among the three groups

3 討論

PCOS 是一種以高雄激素血癥為特征的疾病,可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、胚胎植入失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜功能障礙等[7-9]。mTOR是磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/mTOR信號(hào)通路的成員,該通路涉及許多下游靶點(diǎn),可參與細(xì)胞生長、增殖、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄、血管生成、凋亡和自噬等生物過程[10]。研究表明,mTOR途徑的過度表達(dá)參與PCOS病理生理過程,可導(dǎo)致胰島素抵抗,促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡、膜細(xì)胞的增殖,從而影響卵泡的發(fā)育,雷帕霉素可通過抑制mTOR信號(hào)通路異常激活,保護(hù)卵泡儲(chǔ)備功能[11]。WANG等[12]研究表明,雌激素可誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜組織中p-mTOR、磷酸化核糖體蛋白S6水平明顯升高,雷帕霉素可通過抑制mTOR通路降低p-mTOR、磷酸化核糖體蛋白S6的蛋白質(zhì)和DNA合成,表明雷帕霉素可用于治療雌激素導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜增生性疾病。

本研究通過經(jīng)頸背部皮下注射脫氫表雄酮構(gòu)建PCOS大鼠模型[13-14],造模后,PCOS組、雷帕霉素組大鼠的體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組,符合PCOS大鼠模型的病理特點(diǎn);給藥28 d后,PCOS組大鼠的體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組和雷帕霉素組,雷帕霉素組大鼠的體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組,說明雷帕霉素可抑制PCOS大鼠體質(zhì)量的增加,PCOS組大鼠體質(zhì)量低于對(duì)照組大鼠可能與雷帕霉素濃度過高或雷帕霉素引起的不良反應(yīng)有關(guān),仍待進(jìn)一步研究證明。

本研究中,HE染色顯示,雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目較多,呈簇狀排列,但腺腔多小而直,部分可見到一些皺褶和分支,說明雷帕霉素能緩解PCOS大鼠子宮內(nèi)膜病理形態(tài)改變。本研究結(jié)果顯示,PCOS組和雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積占比顯著高于對(duì)照組,PCOS組與雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積占比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;這說明,PCOS大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度較高,而雷帕霉素并未明顯改善PCOS大鼠子宮內(nèi)膜纖維化情況。

本研究結(jié)果顯示, PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組和雷帕霉素組,對(duì)照組與雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明,PCOS大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡增加,原因可能與mTOR通路異常激活有關(guān)。機(jī)體正常細(xì)胞凋亡可清除子宮內(nèi)膜功能層的衰老細(xì)胞,從而維持內(nèi)膜組織的正常結(jié)構(gòu)和功能,而子宮內(nèi)膜癌早期患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡調(diào)控表現(xiàn)出異常[15]。

有研究表明,雷帕霉素可通過抑制mTOR信號(hào)通路,抑制始基卵泡激活,減緩始基卵泡向生長卵泡的轉(zhuǎn)化速率,保護(hù)卵泡儲(chǔ)備能力并改善排卵功能,并可減少肥胖小鼠的體質(zhì)量,這為解決肥胖女性生育能力的問題帶來了希望[16-17]。本研究結(jié)果顯示,PCOS 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6 的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和雷帕霉素組;雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜組織中p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組;對(duì)照組與雷帕霉素組大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-p70S6的相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明雷帕霉素處理后PCOS大鼠子宮內(nèi)膜組織中mTOR、p-mTOR及mTOR信號(hào)通路下游的p-p70S6水平下調(diào),雷帕霉素可抑制 mTOR信號(hào)通路的異常激活,與YABA等[11]研究一致。

4 結(jié)論

雷帕霉素能緩解PCOS大鼠體質(zhì)量增加、子宮內(nèi)膜病理形態(tài)改變,減少子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制mTOR信號(hào)通路異常激活有關(guān)。本研究僅初步探討了雷帕霉素對(duì)PCOS大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制,雷帕霉素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等其他細(xì)胞過程的影響及機(jī)制尚需深入研究。