發(fā)狀分裂增強(qiáng)子1對(duì)膽固醇刺激下內(nèi)皮細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

何春艷,裴美娟,李玉明,王會(huì)榮

(1.武警特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科,天津 300162;2.武警特色醫(yī)學(xué)中心心血管疾病研究所,天津 300162;3.寶雞市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 寶雞 721000)

動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病是當(dāng)前全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的疾病之一,血漿中低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)濃度與心腦血管疾病的發(fā)生有直接關(guān)系[1-3],但是當(dāng)前的藥物治療手段有限。一項(xiàng)納入25317例接受至少1種降脂藥物治療至少3個(gè)月的中國(guó)血脂異常患者的多中心、橫斷面、非干預(yù)性流行病學(xué)研究[4]顯示,根據(jù)《中國(guó)成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》標(biāo)準(zhǔn),全體患者LDL-C達(dá)標(biāo)率僅為37.3%,僅有26.9%極高危患者LDL-C達(dá)標(biāo),中國(guó)大部分血脂異常患者,特別是高危和極高危的患者,接受以他汀單藥治療為主的降脂治療后血脂仍無(wú)法達(dá)標(biāo)。因此尋找新的藥物治療靶點(diǎn)對(duì)開(kāi)發(fā)新的治療方案具有重要意義。發(fā)狀分裂增強(qiáng)子1(Hairy and enhancer of split homolog-1,HES-1)屬于前神經(jīng)元堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化/增殖中發(fā)揮重要作用[5-6],但是HES-1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,特別是在高膽固醇刺激下發(fā)揮的作用以及潛在的作用通路尚不明確。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建HES-1抑制和過(guò)表達(dá)模型,檢測(cè)在膽固醇刺激下HES-1對(duì)細(xì)胞凋亡和血管生成相關(guān)分子表達(dá)的作用,并觀察無(wú)翼型MMTV家族整合位點(diǎn)(Wingless type MMTV integration site family member,Wnt)/磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)/β-連鎖蛋白(β-catenin)信號(hào)通路的變化,為高膽固醇血癥的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 Ea.hy926細(xì)胞(GNHu39)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)保存委員會(huì)的細(xì)胞庫(kù);胎牛血清(FBS,12484-028)和高糖Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基(H-DMEM,11965-092)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;膽固醇(C4951)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;抗-HES-1(ab108937)、Wnt(ab15251)、AKT(ab8805)、p-AKT(ab38449)、β-catenin(ab32572)、c-myc(ab32072)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2,ab196495)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,ab32503)、Bcl-2相互作用細(xì)胞死亡介質(zhì)(BIM,ab32158)、p-BIM (ab17935)、半胱天冬酶9(Caspase-9,ab32539)、Caspase-3(ab13847)抗體和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β,ab119558)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF,ab239424)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α(VEGF-α,ab100786)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)ELISA試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞模型構(gòu)建:用PCR方法從細(xì)胞中克隆HES-1的cDNA并將HES-1片段克隆到載體中,轉(zhuǎn)染Ea.hy926細(xì)胞48 h后用1000 μg/ml G418篩選穩(wěn)定的HES-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞。構(gòu)建HES-1基因敲除載體,用2 μg/ml puro篩選穩(wěn)定的HES-1基因敲除細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組:將細(xì)胞分為CH組(膽固醇刺激)、GO組(HES-1過(guò)表達(dá)+膽固醇刺激)、GD組(HES-1低表達(dá)+膽固醇刺激)和NC組(空白對(duì)照組),其中,CH組、GO組、GD組給予100 mmol/L膽固醇刺激24 h,NC組不給予任何干預(yù)。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析:配制4%濃縮膠和1×跨膜緩沖液4 ℃?zhèn)溆谩?yīng)用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后進(jìn)行蛋白定量,隨后將蛋白樣品置于100 ℃恒溫孵育器中充分變性。經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和抗體孵育后進(jìn)行顯影和分析,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):將每組細(xì)胞接種到100 mm平板中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁過(guò)夜后抽吸培養(yǎng)基,每孔用PBS沖洗2次。用胰蛋白酶收集細(xì)胞。室溫下以300 g離心細(xì)胞5 min,去上清液,在100 μl 4%多聚甲醛的PBS中重新懸浮,室溫孵育10 min。再次離心細(xì)胞,并將每組細(xì)胞與Annexin V在室溫下孵育15 min,繼而用PI孵育5 min,隨后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn):制備1∶100捕獲抗血清,將50 μl稀釋捕獲抗血清分配到96孔板中,在4 ℃條件下孵化過(guò)夜。次日棄去孔內(nèi)液體,用裂解緩沖液清洗4次。在每孔中加入1%牛血清白蛋白300 μl封閉,室溫下孵育1 h。將50 μl裂解后的細(xì)胞懸液分配到適當(dāng)?shù)目字?室溫下孵化1 h。偶聯(lián)稀釋液中配制成1∶5000的稀釋度,每孔分配50 μl,室溫下孵化1 h。每孔加入125 μl Turbo-TMB,室溫下顯影約15 min,或直到陰性對(duì)照開(kāi)始變?yōu)樗{(lán)色。每孔中加入0.9 mol/L硫酸125 μl停止反應(yīng)。立即在平板閱讀器/分光光度計(jì)上讀取OD450數(shù)值,計(jì)算TGF-β、IGF、VEGF-α和PDGF的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 HES-1差異表達(dá)細(xì)胞模型鑒定 CH組、GO組和GD組細(xì)胞在膽固醇刺激前HES-1表達(dá)水平分別為1.22±0.09、1.46±0.11和0.47±0.04。與CH組比較,GO組HES-1表達(dá)顯著增加,GD組HES-1表達(dá)顯著降低(均P<0.05),提示細(xì)胞模型建立成功。

2.2 各組細(xì)胞凋亡占比比較 NC組、CH組、GO組和GD組凋亡細(xì)胞占比分別為(0.03±0.01)%、(36.03±3.21)%、(56.73±5.48)%和(20.03±2.03)%。與NC組比較,所有膽固醇處理組凋亡細(xì)胞占比顯著增加(均P<0.05)。與CH組比較,GO組凋亡細(xì)胞占比顯著增加(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。與NC組比較,CH組和GO組Bax、Caspase-3、Caspase-9、p-BIM/BIM表達(dá)顯著升高,Bcl-2表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GD組Bax、Caspase-9表達(dá)顯著升高,Bcl-2、Caspase-3表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。與CH組比較,GO組Bax、Caspase-9表達(dá)顯著升高,Bcl-2表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GD組Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p-BIM/BIM表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。與GO組比較,GD組Bax、Caspase-3、Caspase-9、p-BIM/BIM表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.4 各組細(xì)胞血管生成相關(guān)因子表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。與NC組比較,CH組和GO組TGF-β、IGF、VEGF-α、PDGF表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GD組PDGF表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與CH組比較,GO組TGF-β、IGF、VEGF-α、PDGF表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GD組TGF-β、IGF、PDGF表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。與GO組比較,GD組TGF-β、IGF、VEGF-α、PDGF表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。

表2 各組細(xì)胞血管生成相關(guān)因子表達(dá)水平比較(pg/ml)

2.5 各組細(xì)胞Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。與NC組比較,CH組HES-1表達(dá)顯著升高,p-AKT/AKT、c-myc表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GO組HES-1表達(dá)顯著升高,Wnt、p-AKT/AKT、β-catenin、c-myc表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GD組HES-1、Wnt、β-catenin、c-myc表達(dá)顯著降低,p-AKT/AKT顯著升高(均P<0.05)。與CH組比較,GO組HES-1表達(dá)顯著升高,Wnt、p-AKT/AKT、β-catenin、c-myc表達(dá)顯著降低(均P<0.05);GD組HES-1、Wnt、β-catenin表達(dá)顯著降低,p-AKT/AKT、c-myc表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。與GO組比較,GD組HES-1表達(dá)顯著降低,Wnt、p-AKT/AKT、β-catenin、c-myc表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是由動(dòng)脈內(nèi)膜膽固醇過(guò)度沉積引起,可導(dǎo)致心肌梗死、中風(fēng)和周?chē)鷦?dòng)脈疾病的發(fā)生[7-9]。臨床試驗(yàn)和動(dòng)物模型研究[10-12]均發(fā)現(xiàn)血漿中膽固醇濃度與心腦血管疾病發(fā)生率間存在直接相關(guān)性,但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,新的治療策略仍有待進(jìn)一步研發(fā)。

HES-1在多種細(xì)胞進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用,但是其表達(dá)差異對(duì)膽固醇刺激下的血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其潛在作用通路尚不明確。在細(xì)胞凋亡方面,本研究發(fā)現(xiàn)膽固醇刺激可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá),并顯著激活細(xì)胞凋亡過(guò)程,當(dāng)HES-1過(guò)表達(dá)時(shí)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加,保護(hù)蛋白表達(dá)水平降低,細(xì)胞凋亡水平亦增加,敲除HES-1可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這與康麗麗[13]的研究結(jié)果類(lèi)似,其發(fā)現(xiàn)西地那非可通過(guò)抑制HES-1表達(dá),抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。在血管生成方面,本研究發(fā)現(xiàn)膽固醇刺激可抑制血管生成相關(guān)因子表達(dá),敲除HES-1可改善膽固醇對(duì)血管生成因子的影響,提示HES-1過(guò)表達(dá)會(huì)抑制血管生成,敲除HES-1對(duì)血管生成具有保護(hù)作用。姚星星[14]的研究同樣發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈粥樣斑塊組織中Hes-1過(guò)表達(dá)可抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成。Choi等[15]研究發(fā)現(xiàn),HES-1表達(dá)水平升高,骨橋蛋白水平降低,人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化減少。

進(jìn)一步研究HES-1對(duì)細(xì)胞凋亡及血管生成影響的潛在機(jī)制發(fā)現(xiàn),HES-1過(guò)表達(dá)后Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路受到抑制。PI3K/AKT信號(hào)通路與凋亡密切相關(guān)。徐梅玲等[16]研究表明,過(guò)表達(dá)LINC00189可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路抑制成骨細(xì)胞凋亡。Wnt信號(hào)通路不僅是發(fā)育生物學(xué)中的關(guān)鍵通路,也是血管生成的關(guān)鍵通路。胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程是在Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控下進(jìn)行的[17]。李清等[18]研究證明,miR-26a能靶向激活PI3K/AKT信號(hào)通路,上調(diào)血管生成相關(guān)因子,促進(jìn)腦梗死大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成。閆歡歡等[19]研究發(fā)現(xiàn),miR-28-3p抑制劑可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路,進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜中血管生成。Meng等[20]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),鞣花酸通過(guò)抑制Wnt/β-catenin和PI3K/AKT途徑抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果提示,敲除HES-1基因可促進(jìn)Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路激活,抑制凋亡并促進(jìn)血管生成相關(guān)因子表達(dá),表明Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路是HES-1發(fā)揮作用的潛在通路之一。

綜上所述,本研究首先建立了HES-1在Ea.hy926細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)和敲除細(xì)胞模型,檢測(cè)了細(xì)胞在膽固醇刺激下凋亡蛋白和血管生成因子的表達(dá)差異,進(jìn)一步探索潛在機(jī)制,發(fā)現(xiàn)HES-1過(guò)表達(dá)可抑制Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制血管生成因子生成,而HES-1基因敲除后可緩解這種趨勢(shì),為治療心血管疾病提供了新的思路,有待更多的動(dòng)物及人體試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。