食管鱗癌組織中c-myc、神經鞘胚素表達及其與患者臨床病理特征和預后關系研究

馬西淼,華永永,邱瓊香,CHAROENTHAMMAKIT Panida(泰國)

(1.海口市人民醫院 中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院胸部外科,海南 海口 570208;2.天津中醫藥大學,天津 301617)

食管癌是全球八大常見惡性腫瘤之一。世界衛生組織調查報告[1]顯示,2012年全球食管癌新發病例約45.6萬。我國是食管癌高發國家,也是食管癌病死率最高的國家,其發病率在各類腫瘤中居第5位,病死率居第4位[2]。c-myc蛋白是一種核轉錄因子,參與DNA復制、激活以及與生長相關基因的轉錄,抑制細胞的凋亡,促進腫瘤的發生、發展[3]。有研究[4]表明,胃癌組織中c-myc高表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、組織學分型、病灶侵襲深度及預后有關,提示c-myc可能參與胃癌的發生和發展。神經鞘胚素(Artemin)是膠質細胞源性神經營養因子(Glial-derived neurotrophic factor,GDNF)家族配體,屬于轉化生長因子β的超家族,同時Artemin也是分泌性的磷酸化糖蛋白,具有促進細胞趨化、黏附及遷移的作用[5]。研究[6]表明,食管鱗狀細胞癌中Artemin高表達與腫瘤生物學特征密切相關,Artemin可能促進腫瘤浸潤及進展。目前,關于兩者在食管鱗癌組織中的表達及相關性研究較少。因此,本研究探討c-myc、Artemin在食管鱗癌組織中的表達情況及其與患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年7月至2017年12月于海口市人民醫院胸部外科接受手術治療的食管鱗癌患者75例,采集食管鱗癌組織及癌旁組織標本。病例納入標準:行食管癌根治術且經病理學診斷確診為食管鱗癌;符合第7版食管癌TNM分期標準;年齡<80歲;對本研究均知情同意。排除標準:合并有其他惡性腫瘤;術前已進行放、化療等治療;切緣距腫瘤距離≤3 cm;臨床、病理學資料不全;隨訪期間失訪。75例患者中,男性43例,女性32例;年齡38～77歲,平均(55.73±10.02)歲;腫瘤直徑≥3 cm 47例,<3 cm 28例;食管上段11例,中段37例,下段27例;浸潤深度中,T14例,T212例,T339例,T420例;分化程度中,高分化18例,中分化30例,低分化27例;發生淋巴結轉移46例,未發生淋巴結轉移29例;TNM分期中,Ⅰ期8例,Ⅱ期31例,Ⅲ期36例。本研究經海口市人民醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 組織c-myc、Artemin檢測:采用免疫組化(SP法)檢測標本組織中c-myc、Artemin的表達情況,并通過重復試驗進行驗證。其中,鼠抗人c-myc單克隆抗體(批號:GB12076)、羊抗人Artemin單克隆抗體(批號:GB13534)、SP超敏試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物公司。檢測結果由2名病理科中級以上職稱醫師根據雙盲原則判定。c-myc陽性表達為細胞漿或細胞核出現棕黃色顆粒,根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例及陽性細胞染色強度判斷每個視野的結果。采用二級計分法判讀:①染色強度方面,細胞無著色計0分,黃色計1分,棕黃色計2分,棕褐色計3分。②陽性細胞計數:在400倍鏡下隨機選取10個視野,每個視野選取100個腫瘤細胞,計算陽性染色細胞占比,0%～10%計1分,11%～49%計2分,50%～75%計3分,≥76%計4分。兩者計分相乘后,0～3分為陰性,≥3分為陽性。Artemin陽性表達為細胞膜和(或)細胞質出現棕黃(褐)色顆粒,綜合考慮陽性表達細胞百分數以及染色強度兩個方面:在100倍顯微鏡視野下隨機選取20個細胞,計算陽性表達細胞占比,0%～5%計0分,5%～25%計1分,25%～50%計2分,50%～75%計3分,≥76%計4分;染色強度計分中,細胞無著色計0分,淡黃色計1分,棕黃色計2分,棕褐色計3分。兩者乘積0～4分為陰性,≥5分為陽性。

1.2.2 術后隨訪:所有患者術后隨訪3年,術后半年內根據患者情況每2～4周復查1次,之后每3～6個月復查1次。隨訪以來院復查或電話方式進行,記錄患者預后情況。

2 結 果

2.1 食管鱗癌及癌旁組織c-myc、Artemin表達情況 見圖1。食管鱗癌組織中c-myc陽性表達率為62.67%(47/75),高于癌旁組織的42.67%(32/75),差異有統計學意義(χ2=6.017,P=0.014)。食管鱗癌組織中Artemin陽性表達率為78.67%(59/75),高于癌旁組織的44.00%(33/75),差異有統計學意義(χ2=19.003,P=0.000)。

2.2 食管鱗癌組織c-myc、Artemin表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。食管鱗癌組織中c-myc表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度以及TNM分期有關(均P<0.05)。食管鱗癌組織中Artemin表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期有關(均P<0.05)。

表1 食管鱗癌組織c-myc、Artemin表達與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 食管鱗癌組織c-myc與Artemin表達的相關性 Spearman相關性分析結果顯示,食管鱗癌組織中c-myc與Artemin的表達呈正相關(r=0.406,P=0.012)。

2.4 食管鱗癌患者單因素生存分析 見表2。截止到隨訪時間,食管鱗癌患者病死22例,存活51例,失訪2例,最終納入73例食管鱗癌患者進行生存分析。單因素生存分析結果顯示,食管鱗癌患者預后與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、c-myc表達以及Artemin表達有關(均P<0.05)。

表2 食管鱗癌患者單因素生存分析(月)

2.5 食管鱗癌患者預后影響因素Cox回歸分析 見表3。多因素Cox回歸分析結果顯示,有淋巴結轉移、腫瘤低分化、TNM分期Ⅲ期、c-myc表達陽性、Artemin表達陽性是食管鱗癌患者預后的獨立危險因素(均P<0.05)。

表3 食管鱗癌患者預后影響因素Cox回歸分析

3 討 論

c-myc蛋白參與細胞增殖、分化以及凋亡,當其過度表達時,可引發細胞過度增殖、惡變,促進腫瘤的發生[7]。近年來,研究[8-10]發現c-myc在膽囊癌、宮頸癌以及結直腸癌等惡性腫瘤組織中高表達,且與腫瘤生物學特征密切相關。王媛媛等[11]研究表明,溶質載體家族1成員5(SLC1A5)和谷氨酰胺酶2(GLS2)靶向抑制劑可通過調控甲狀腺癌c-myc表達而發揮抗細胞生物活性的作用。本研究發現,c-myc在食管鱗癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織,呈過度表達狀態;c-myc表達與腫瘤分化程度、浸潤深度以及TNM分期有關,與患者腫瘤大小、病變部位以及淋巴結轉移無關。提示c-myc與食管鱗癌發生、發展存在一定聯系。

在食管癌的TNM分期中,c-myc與腫瘤浸潤深度密切相關,而與淋巴結轉移無明顯相關。李琛等[12]研究表明,c-myc可被三結構域蛋白59(TRIM59)誘導,從而在非小細胞肺癌中高表達,且c-myc表達與TRIM59呈明顯正相關。郭春華等[13]研究表明,c-myc可通過影響WW結構域E3泛素連接酶1基因轉錄水平,進而實現對肝腫瘤HepG2細胞內蛋白激酶第10號染色體同源丟失性磷酸酶基因和張力蛋白表達的調控,參與肝癌的發生、發展。本研究結果表明,c-myc可通過影響腫瘤本身的發展來影響食管鱗癌的臨床分期。馬小平等[14]研究表明,c-myc信號通路被激活后可促進食管癌細胞增殖,影響腫瘤生物學進程,提示c-myc可能影響食管癌患者預后。本研究中,c-myc表達陽性是食管鱗癌患者預后的獨立危險因素,提示c-myc陽性表達與食管鱗癌患者預后有關。

Artemin是GDNF家族的第4個成員,可與其他受體相結合,促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[15]。研究[16]發現,Artemin能促進軸突生長,在神經細胞損傷修復過程中發揮巨大作用。近年來,研究[17-19]發現Artemin在子宮內膜癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達,且與腫瘤臨床病理特征及預后有關。本研究發現,Artemin在食管鱗癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織,呈過度表達狀態;且Artemin表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移以及臨床分期有關,與患者腫瘤大小、病變部位以及分化程度無關。提示Artemin可能參與了腫瘤轉移的過程。胡軍等[20]研究發現,Artemin在軟骨肉瘤組織中高表達,且與血管內皮細胞生長因子、血管密度呈正相關,提示Artemin除了可促進淋巴結轉移外,還可能與血液轉移有關。本研究中,Artemin表達陽性是食管鱗癌患者預后的獨立危險因素,提示Artemin陽性表達與食管鱗癌患者預后有關。由于Artemin可促進血管生成因子過表達,通過調控缺氧誘導因子-1α信號通路促進血管新生,進而為細胞增殖、侵襲、轉移提供養分[21]。于海葉等[22]研究發現,腫瘤臨床分期、淋巴結轉移及組織學類型均是食管鱗狀細胞癌患者預后的獨立危險因素。本研究發現,有淋巴結轉移、低分化、TNM分期Ⅲ期是食管鱗癌患者預后的獨立危險因素,與上述研究結果類似。多因素Cox回歸分析顯示腫瘤浸潤深度與食管鱗癌患者預后無關,考慮與樣本量、腫瘤類型及病例個體差異等因素等有關。本研究結果顯示,食管鱗癌組織中c-myc表達與Artemin表達呈正相關,但其具體機制仍不明確,國內外也缺乏相關報道,考慮與癌基因的級聯放大效應有關,有待深入研究。

綜上所述,c-myc、Artemin在食管鱗癌組織中過度表達,前者與腫瘤分化程度、浸潤深度以及TNM分期有關,后者與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移以及臨床分期有關,兩者陽性表達均是食管鱗癌患者預后的獨立危險因素,可作為判斷食管鱗癌患者預后的生物學指標。