長(zhǎng)鏈非編碼RNA YAF2-AS1通過(guò)調(diào)控微小RNA-141-3p表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)研究

劉 俊,曾 龍,高 云,敖會(huì)芳,林 勇,魏雪源

(1.荊門(mén)市人民醫(yī)院 荊楚理工學(xué)院附屬中心醫(yī)院感染性疾病科,湖北 荊門(mén) 448000;2.荊門(mén)市人民醫(yī)院 荊楚理工學(xué)院附屬中心醫(yī)院血液內(nèi)科,湖北 荊門(mén) 448000;3.上海長(zhǎng)征醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200003)

肝纖維化是以肝組織結(jié)構(gòu)改變以及肝功能損傷為特征的一類疾病,其發(fā)生率在近幾十年中快速增長(zhǎng)[1]。肝纖維化的發(fā)生與病毒感染、肥胖、藥物、糖尿病以及酗酒等因素相關(guān),是肝硬化和肝癌發(fā)生的重要原因[2]。大量研究[3-4]證實(shí),肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞活化。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是內(nèi)源性長(zhǎng)鏈RNA,屬于單鏈RNA家族,通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平修飾調(diào)控基因的表達(dá),參與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。研究[7-8]報(bào)道,lncRNA與肝星狀細(xì)胞的活化和凋亡有關(guān),是肝纖維化診斷、分型、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)的靶點(diǎn)。YAF2-AS1是由396個(gè)核苷酸組成的lncRNA,其編碼基因位于人染色體12q12區(qū)域,含有3個(gè)外顯子。目前關(guān)于YAF2-AS1在肝纖維化中的作用和機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究探討YAF2-AS1在肝纖維化組織中的表達(dá)水平,觀察YAF2-AS1對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的作用及機(jī)制,為YAF2-AS1/micro-RNA-141-3p(miR-141-3p)在肝纖維化診療和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要試劑 人肝星狀細(xì)胞株LX-2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(批號(hào):12491015、A4766801)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;CCK-8實(shí)驗(yàn)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):C0039、C1052、S0033M)購(gòu)自上海碧云天生物有限公司;miR-141-3p、mimic NC、YAF2-AS1質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒(批號(hào):L4535、L3050、H189、H238)購(gòu)自上海集奇生物科技有限公司;Lipofectamine 3000、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(批號(hào):L3000008、12361010)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;熒光素酶野生型質(zhì)粒pMIR-YAF2-AS1 WT、突變型質(zhì)粒pMIR-YAF2-AS1 MUT(批號(hào):GF22111-5191、GF22111-5192)購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司;雙熒光素酶活性試劑盒(批號(hào):150327)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;兔抗人磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)、兔抗人磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、兔抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、兔抗人Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ(TGFβR2)、兔抗人β微管蛋白(β-Tubulin)抗體(批號(hào):ab267787、ab8805、ab5831、ab138492、ab184948、ab18207)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析:采用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)分析YAF2-AS1在肝纖維化組織和正常肝組織中的表達(dá)。使用lncRMap軟件預(yù)測(cè)YAF2-AS1的靶向基因。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:配制含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)LX-2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前16 h,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞接種于12孔板,每孔2 ml。通過(guò)Lipofectamine 3000試劑將陰性對(duì)照質(zhì)粒(對(duì)照組)和YAF2-AS1質(zhì)粒(YAF2-AS1組)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染濃度為70 nmol/L,轉(zhuǎn)染7 h后更換培養(yǎng)基。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)YAF2-AS1和miR-141-3p表達(dá):提取各組LX-2細(xì)胞總RNA,通過(guò)核酸檢測(cè)儀分析RNA濃度,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)置qRT-PCR參數(shù):96 ℃ 6 min;96 ℃ 16 s,56 ℃ 26 s,64 ℃ 26 s,共39個(gè)循環(huán)。采集各循環(huán)的熒光信號(hào),分析熔解曲線。以U6和GAPDH為內(nèi)參,引物序列見(jiàn)表1。以2-ΔΔCt法分析YAF2-AS1和miR-141-3p表達(dá)。

表1 各基因引物序列

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)LX-2細(xì)胞增殖:收集各組LX-2細(xì)胞,以1500個(gè)/孔接種于96孔板,在37 ℃、5% CO2環(huán)境中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。配制體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK-8試劑,在每天恒定時(shí)間點(diǎn)于每孔加入25 μl CCK-8試劑,在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)3 h,通過(guò)酶標(biāo)儀分析各孔LX-2細(xì)胞在波長(zhǎng)450 nm處的光密度值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LX-2細(xì)胞周期:采用胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集各組LX-2細(xì)胞,用3 ml 80%乙醇固定。12 h后,離心棄上清。磷酸緩沖鹽溶液清洗2次,加入RNA酶重懸,在37 ℃環(huán)境培養(yǎng)40 min。110 μl碘化丙啶溶液染色20 min。篩網(wǎng)過(guò)濾到流式細(xì)胞管,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組LX-2細(xì)胞周期。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LX-2細(xì)胞ROS水平:采用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),稀釋比例為800∶1。收集各組LX-2細(xì)胞,重懸于DCFH-DA溶液中,在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)20 min,每隔4 min顛倒混勻,保證探針與LX-2細(xì)胞充分接觸。使用不含血清的培養(yǎng)基清洗LX-2細(xì)胞4次,過(guò)濾到流式細(xì)胞管,流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。

1.2.7 雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YAF2-AS1和miR-141-3p的靶向結(jié)合:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞接種于24孔板,設(shè)置mimi NC/pMIR-YAF2-AS1 WT組、miR-141-3p/pMIR-YAF2-AS1 WT組、mimi NC/pMIR-YAF2-AS1 MUT組、miR-141-3p/pMIR-YAF2-AS1 MUT組,通過(guò)Lipofectamine 3000將質(zhì)粒和miRNA轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞。在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)30 h,根據(jù)雙熒光素酶活性試劑盒分析各組LX-2細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測(cè)PTEN/AKT信號(hào)通路蛋白和肝纖維化標(biāo)志物表達(dá):各組LX-2細(xì)胞中加入RIPA裂解液,超聲裂解7次,冰上孵育15 min,高速離心取上清,與上樣緩沖液搖床混勻,煮沸9 min。用8% SDS-PAGE膠分離各組LX-2細(xì)胞總蛋白,轉(zhuǎn)膜蛋白到聚偏二氯乙烯膜。用6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白溶液室溫封閉50 min。加入兔抗人PTEN(1∶2000稀釋)、兔抗人p-AKT(1∶1000稀釋)、兔抗人α-SMA(1∶3000稀釋)、兔抗人Collagen I(1∶2000稀釋)、兔抗人TGFβR2(1∶3000稀釋)、兔抗人β-Tubulin(1∶3000稀釋,內(nèi)參),孵育15 h。洗膜后,加入羊抗兔二抗(1∶6000稀釋)孵育3 h。洗膜后,在化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光和成像。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,與正常肝組織比較,肝纖維化組織中YAF2-AS1表達(dá)水平降低(P<0.01)。

2.2 兩組LX-2細(xì)胞YAF2-AS1表達(dá)量比較 qRT-PCR結(jié)果顯示,YAF2-AS1組LX-2細(xì)胞YAF2-AS1表達(dá)量高于對(duì)照組(9.98±1.45與1.02±0.40,P<0.01)。

2.3 過(guò)表達(dá)YAF2-AS1對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)圖1。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,YAF2-AS1組LX-2細(xì)胞從第2 天開(kāi)始增殖受到抑制(均P<0.05)。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01

2.4 過(guò)表達(dá)YAF2-AS1對(duì)LX-2細(xì)胞周期的影響 見(jiàn)圖2。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,YAF2-AS1組在G0/G1期細(xì)胞比例升高,S期和G2/M期細(xì)胞比例降低(均P<0.05)。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01

2.5 過(guò)表達(dá)YAF2-AS1對(duì)LX-2細(xì)胞ROS含量的影響 見(jiàn)圖3。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,YAF2-AS1組LX-2細(xì)胞ROS含量升高(P<0.01)。

注:與對(duì)照組比較,#P<0.01

2.6 YAF2-AS1對(duì)miR-141-3p的靶向調(diào)控作用 見(jiàn)圖4、5。lncRMap軟件分析結(jié)果顯示,YAF2-AS1與miR-141-3p存在結(jié)合位點(diǎn),YAF2-AS1和miR-141-3p可能靶向結(jié)合。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)顯示,與mimic NC比較,miR-141-3p共轉(zhuǎn)染pMIR-YAF2-AS1 WT質(zhì)粒后的熒光素酶活性降低(P<0.01),miR-141-3p共轉(zhuǎn)染pMIR-YAF2-AS1 MUT質(zhì)粒后的熒光素酶活性無(wú)明顯改變(P>0.05)。

圖4 YAF2-AS1與miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)

注:與mimic NC比較,#P<0.01

2.7 過(guò)表達(dá)YAF2-AS1對(duì)miR-141-3p表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示,YAF2-AS1組miR-141-3p表達(dá)水平低于對(duì)照組(0.99±0.36與6.38±0.52,P<0.01)。

2.8 過(guò)表達(dá)YAF2-AS1對(duì)PTEN/AKT信號(hào)通路蛋白和肝纖維化標(biāo)志物表達(dá)的影響 見(jiàn)圖6。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)YAF2-AS1后PTEN蛋白表達(dá)升高,p-AKT蛋白及肝纖維化標(biāo)志物α-SMA、Collagen Ⅰ和TGFβR2表達(dá)降低(均P<0.05)。

圖6 PTEN/AKT信號(hào)通路蛋白和肝纖維化標(biāo)志物蛋白電泳圖

3 討 論

肝星狀細(xì)胞在各種慢性肝損傷的刺激下活化并分泌膠原,促進(jìn)肝組織纖維化[9]。有效阻斷肝星狀細(xì)胞的活化,減少膠原的分泌和沉積,可能是抑制肝組織發(fā)生纖維化的重要途徑[10]。lncRNA在非酒精性脂肪性肝病、肝癌、急慢性肝炎等肝臟疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-13]。越來(lái)越多的研究[14-16]證實(shí),lncRNA可能與肝星狀細(xì)胞的活化密切相關(guān)。例如,肝臟組織lncRNA H19表達(dá)水平與肝纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān),沉默lncRNA H19能夠有效抑制肝星狀細(xì)胞的活性,減少成纖維細(xì)胞的增殖和基質(zhì)形成,預(yù)防肝纖維化[17]。lncRNA SNHG7在肝纖維化組織和肝星狀細(xì)胞中明顯升高,靶向抑制lncRNA SNHG7可以減輕動(dòng)物模型的肝纖維化,miR-29b是lncRNA SNHG7的靶基因[18]。目前,YAF2-AS1在肝纖維化發(fā)生中的作用并不清楚。

本研究顯示,肝纖維化組織中YAF2-AS1的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織,說(shuō)明YAF2-AS1可能參與調(diào)控肝纖維化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染YAF2-AS1質(zhì)粒后肝星狀細(xì)胞LX-2的增殖能力明顯降低,LX-2細(xì)胞周期被抑制在G0/G1期,同時(shí)LX-2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高,提示YAF2-AS1能夠顯著抑制肝星狀細(xì)胞LX-2的活化。且YAF2-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后,肝纖維化標(biāo)志物α-SMA、Collagen Ⅰ、TGFβR2表達(dá)均降低,表明YAF2-AS1對(duì)肝纖維化有抑制作用。后基因組學(xué)研究[19-21]顯示,lncRNA充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA,靶向結(jié)合miRNA的反應(yīng)元件,調(diào)控細(xì)胞的病理生理過(guò)程。本研究采用生物信息學(xué)軟件lncRMap分析YAF2-AS1的靶向基因,結(jié)果表明miR-141-3p與YAF2-AS1存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)YAF2-AS1可結(jié)合miR-141-3p。

近年來(lái),miR-141-3p被證實(shí)在多種腫瘤如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、腎透明細(xì)胞癌以及鼻咽癌中異常表達(dá),是診斷腫瘤的分子標(biāo)志物,且miR-141-3p在調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲、代謝、增殖和遷移等活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[22-24]。研究[25]發(fā)現(xiàn),miR-141-3p能夠有效促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖能力,誘導(dǎo)細(xì)胞周期的進(jìn)展,降低細(xì)胞的凋亡水平,同時(shí)升高細(xì)胞的促纖維化蛋白,顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染YAF2-AS1質(zhì)粒后肝星狀細(xì)胞LX-2中miR-141-3p表達(dá)下調(diào),證實(shí)YAF2-AS1能夠抑制miR-141-3p表達(dá)。有研究[25]顯示,miR-141-3p主要通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)通路在肝纖維化的過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。為進(jìn)一步證實(shí)YAF2-AS1對(duì)miR-141-3p表達(dá)的抑制作用,本研究觀察了YAF2-AS1對(duì)PTEN/AKT信號(hào)通路的調(diào)控功能,結(jié)果顯示YAF2-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)升高,p-AKT蛋白表達(dá)降低。

綜上所述,YAF2-AS1在肝纖維化組織中表達(dá)降低,其通過(guò)下調(diào)miR-141-3p表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞的活化。YAF2-AS1調(diào)控miR-141-3p通路表達(dá)可能為肝纖維化診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供新標(biāo)志物和靶點(diǎn)。