微小RNA-19a-3p對充血性心力衰竭模型大鼠心肌纖維化的影響及機制研究

劉 鵬,陳 陣

(武漢市中醫醫院心內科,湖北 武漢 430010)

充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF) 指由于心室充盈或泵血功能障礙,導致心排血量無法滿足機體代謝需要的綜合征[1]。盡管CHF在診斷方面取得了進展,但其發病率和病死率仍然較高[2]。因此,探究CHF發生的分子機制對于CHF的治療具有重要意義。許多微小RNA(microRNA,miR)被認為是診斷和治療疾病的生物標志物和可能的治療靶點[3]。miR-19a-3p位于人14號染色體,是長度約82 bp的非編碼RNA[4]。研究[5]報道,上調miR-19a-3p水平可減輕心力衰竭中心肌細胞的肥大。另外,心肌纖維化在心力衰竭的發生、發展中發揮重要的作用[6]。目前,關于miR-19a-3p對CHF大鼠心肌纖維化的影響鮮有報道。因此,本研究通過構建CHF大鼠模型,探討miR-19a-3p對CHF大鼠心肌纖維化的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只,體重180～200 g,購自廣州銳格生物公司,生產許可證號:SCXK(粵)2021-0059。所有大鼠喂養于有溫控、12 h明暗循環的環境中,自由飲水和進食。本研究動物實驗符合3R原則,獲得本院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 miR-19a-3p激動劑(miR-19a-3p agomir,貨號:20221205)及其陰性對照(NC agomir,貨號:20221208)均購自廣州銳博生物技術有限公司;腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制劑Compound C(批號:S7840)購自MCE公司;兔源一抗沉默信息調節因子1(SIRT1,貨號:K000319P)、AMPK(貨號: K106707P)、 三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,貨號:K206390M)及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(貨號:SE134)、Masson三色染色試劑盒(貨號:G1340)、2×SYBR Green PCR Mastermix(貨號:SR1110)購自北京索萊寶科技有限公司;Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ,貨號:ab34710)、Collagen Ⅲ(貨號:ab7778)、轉化生長因子-β(TGF-β,貨號:ab31013)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α,貨號:ab191838)、p-AMPK(貨號:ab23875)購自美國Abcam公司;Prime ScriptTMRT Master Mix(貨號:RR036A-1)購自日本TAKARA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CHF模型構建:麻醉大鼠后,在劍突下腹部正中線處分離腹主動脈,將7號注射器針頭放于腹主動脈上,與腹主動脈平行,用0號手術線結扎腹主動脈和針頭后將針頭抽出,構建腹主動脈狹窄來誘發CHF[7]。建模4周后,行心臟彩超檢測左心室射血分數(LVEF),若LVEF≤45%則表示造模成功[8]。

1.3.2 實驗分組與處理:將大鼠分為對照組(NC組)、模型組(Model組)、NC agomir組、miR-19a-3p agomir組、miR-19a-3p agomir+Compound C組,每組12只。其中,NC組僅暴露腹主動脈不結扎,其他組均構建CHF模型(各組大鼠均造模成功);NC agomir組和miR-19a-3p agomir組分別通過尾靜脈注射NC agomir和miR-19a-3p agomir;miR-19a-3p agomir+Compound C組除需尾靜脈注射miR-19a-3p agomir外,還需注射250 μg/kg Compound C[9],每3天注射1次,持續15 d。15 d后檢測大鼠血流動力學參數及心臟功能指標。然后處死大鼠,收集心肌組織,一部分固定于4%多聚甲醛中,另一部分凍存于-80 ℃冰箱中(每部分包含6只大鼠心肌組織)。

1.3.3 血流動力學參數檢測:末次給藥禁食12 h后,用2.5%異氟醚麻醉大鼠,通過右頸動脈穿過主動脈瓣插入微壓計尖端導管,采用Power Lab數據采集系統觀察并記錄左心室收縮壓(LVSP)、左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)。

1.3.4 心臟功能指標檢測:麻醉大鼠后,使用超聲波和21 MHz探頭在左心室長軸乳頭肌水平處檢測心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、室間隔厚度(IVS)和LVEF。

1.3.5 Masson染色檢測心肌纖維化:用100 mg/kg戊巴比妥鈉處死大鼠,磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注后取出心臟,采用Masson三色染色試劑盒檢測厚5 μm的心肌組織切片的纖維化程度,用光學顯微鏡觀察大鼠心肌纖維化情況。

1.3.6 Western blot檢測蛋白表達:用RIPA裂解緩沖液裂解并提取心肌組織總蛋白,BCA法進行蛋白質定量后,取50 μg蛋白質電泳,轉移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h,在4 ℃下加入一抗Collagen Ⅰ(1∶2000稀釋)、Collagen Ⅲ(1∶1000稀釋)、TGF-β(1∶1000稀釋)、AMPK(1∶1000稀釋)、SIRT1(1∶2000稀釋)、PGC-1α(1∶2000稀釋)、p-AMPK(1∶2000稀釋)、GAPDH(1∶2000稀釋),孵育過夜后與二抗(1∶2000稀釋)共同孵育1 h。加入ECL試劑后觀察蛋白顯色情況,通過Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miR-19a-3p表達:用TRIzol試劑提取心肌組織勻漿總RNA,采用Prime ScriptTMRT Master Mix將RNA反轉錄為cDNA,用2×SYBR Green PCR Mastermix進行PCR反應。miR-19a-3p正向引物序列為5’-CAATCCTCTCAGGCTCAGTCC-3’,反向引物序列為5’-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3’;以U6為內參,其正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCACCACA-3’,反向引物序列為5’-AACGGTTCACGGATTTGCGT-3’。miR-19a-3p的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2 結 果

2.1 各組大鼠血流動力學參數比較 見表1。與NC組比較,Model組大鼠LVSP、+dp/dtmax降低(均P<0.05)。與Model組和NC agomir組比較,miR-19a-3p agomir組大鼠LVSP、+dp/dtmax升高(均P<0.05)。與miR-19a-3p agomir組比較,miR-19a-3p agomir+Compound C組大鼠LVSP、+dp/dtmax降低(均P<0.05)。

表1 各組大鼠血流動力學參數比較

2.2 各組大鼠心臟功能指標比較 見表2。與NC組比較,Model組大鼠LVESD、LVEDD、IVS升高,LVEF降低(均P<0.05)。與Model組和NC agomir組比較,miR-19a-3p agomir組大鼠LVESD、LVEDD、IVS降低,LVEF升高(均P<0.05)。與miR-19a-3p agomir組比較,miR-19a-3p agomir+Compound C組大鼠LVESD、LVEDD、IVS升高,LVEF降低(均P<0.05)。

表2 各組大鼠心臟功能指標比較

2.3 各組大鼠心肌Masson染色結果 見圖1。經Masson染色后,膠原纖維呈藍色,心肌細胞呈紅色。與NC組比較,Model組心肌纖維化程度加重。與Model組和NC agomir組比較,miR-19a-3p agomir組心肌纖維化程度減輕。與miR-19a-3p agomir組比較,miR-19a-3p agomir+Compound C組心肌纖維化程度加重。

注:A為NC組;B為Model組;C為NC agomir組;D為miR-19a-3p agomir組;E為miR-19a-3p agomir+Compound C組

2.4 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達比較 見表3。與NC組比較,Model組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達升高(均P<0.05)。與Model組、NC agomir組比較,miR-19a-3p agomir組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達降低(均P<0.05)。與miR-19a-3p agomir組比較,miR-19a-3p agomir+Compound C組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達升高(均P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達比較

2.5 各組大鼠心肌組織miR-19a-3p和AMPK/SIRT1/PGC-1α通路相關蛋白表達比較 見表4。與NC組相比,Model組miR-19a-3p表達水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。與Model組和NC agomir組比較,miR-19a-3p agomir組miR-19a-3p表達水平以及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達升高(均P<0.05)。與miR-19a-3p agomir組比較,miR-19a-3p agomir+Compound C組miR-19a-3p表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織miR-19a-3p和AMPK/SIRT1/PGC-1α通路相關蛋白表達比較

3 討 論

CHF是由結構性或功能性心臟病引起的復雜綜合征,可使心室射血或充血功能障礙[10-11]。出現CHF前會發生左心室重構,其特征是心肌纖維化形成,包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β增加[12-14]。心肌纖維化是CHF進展的主要驅動因素,過度纖維化會引發大面積的梗死瘢痕,導致心臟血流動力學受損及心臟功能障礙[15]。本研究通過構建CHF大鼠模型,經Masson染色后發現,與NC組比較,Model組大鼠心肌纖維化程度加重,促纖維相關指標Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達顯著升高,血流動力學參數LVSP、+dp/dtmax顯著降低,心臟功能相關指標LVESD、LVEDD、IVS顯著升高,LVEF顯著降低,提示CHF大鼠存在心肌纖維化、血流動力學受損以及心臟功能障礙。

miRNA是天然存在的小非編碼RNA。有研究[16-17]證明,miRNA在心力衰竭中失調。研究[18]發現,miR-19a-3p在心力衰竭患者的血漿中低表達,過表達miR-19a-3p可降低TGF-β1信號誘導的人心臟成纖維細胞纖維化。而關于miR-19a-3p對CHF大鼠心肌纖維化影響的相關研究較少。本研究結果顯示,miR-19a-3p在CHF大鼠心肌組織中低表達,過表達miR-19a-3p后CHF大鼠心肌纖維化程度減輕,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β蛋白表達顯著降低,LVEDD、IVS顯著降低,LVEF顯著升高,表明過表達miR-19a-3p可改善CHF大鼠心肌纖維化,減輕血流動力學受損及心臟功能障礙。提示miR-19a-3p可能成為治療CHF的潛在有效靶點。

眾所周知,AMPK和SIRT1在肌纖維類型轉換和肌肉能量代謝中發揮重要作用[19-20]。AMPK是維持細胞能量穩態的能量傳感器,激活的AMPK會增加細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平,進而激活SIRT1并最終催化PGC-1α脫乙酰化[21]。研究[22]發現,白藜蘆醇通過激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促進肌纖維類型從快肌纖維類型轉換為慢肌纖維。丹七片可激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路,改善缺血性心臟病大鼠的心臟功能,防止心肌損傷[23-24]。本研究結果顯示,與NC組比較,Model組p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達顯著降低,提示AMPK/SIRT1/PGC-1α通路可能參與了CHF大鼠心肌纖維化過程。與Model組、NC agomir組比較,miR-19a-3p agomir組p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達顯著升高,推測過表達miR-19a-3p可能通過激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路抑制CHF大鼠心肌纖維化。為了驗證該推測,本研究在過表達miR-19a-3p的基礎上采用AMPK抑制劑Compound C干預CHF大鼠,結果發現Compound C可減弱過表達miR-19a-3p對CHF大鼠心肌纖維化、血流動力學受損及心臟功能障礙的改善作用。

綜上所述,過表達miR-19a-3p可能通過激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路抑制CHF大鼠心肌纖維化,改善血流動力學受損以及心臟功能障礙。miR-19a-3p可能成為治療CHF的潛在靶點。然而,過表達miR-19a-3p抑制CHF大鼠心肌纖維化機制較復雜,miR-19a-3p具體通過AMPK/SIRT1/PGC-1α通路下游的哪些蛋白行使功能尚不明確,有待進一步分析研究。