吉西他濱聯合熱療對胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響及機制研究

習 攀,王 蒨,郭俊俊,李 量,張 璞

(1.陜西省腫瘤醫院放療科,陜西 西安 710061;2.陜西省核工業二一五醫院胸外科,陜西 咸陽 712000)

胰腺癌是具侵襲性和難治的消化道惡性腫瘤之一,預后不良。根據流行病學資料[1]顯示,胰腺癌將在2040年超過結直腸癌成為全球癌癥相關死亡的第二大癌種。早期胰腺癌一般無癥狀,發展至局部晚期可表現為腹痛、體重減輕、黃疸、惡心、疲勞等癥狀[2-4]。因此,一旦出現這些癥狀,超過80%的患者已處于局部晚期或者晚期。到目前為止,外科手術仍是治療胰腺癌的重要方法之一,但只適用于15%左右的病例[5-7]。少于8%的胰腺癌患者存活超過5年[8-10]。所以,在無法早期診斷和切除的情況下,迫切需要更有效的治療手段。

以吉西他濱(Gemcitabine,GEM)為代表的化療藥物,目前仍是局部晚期、不可切除的晚期胰腺癌的治療首選。然而,由于獲得性耐藥等原因,臨床獲益不超過3個月[11-12]。熱化療作為一種很有前景的腫瘤治療方法,可通過改善化療敏感性來提高治療效果[13]。相關研究[14]發現,17例胰腺癌患者使用熱化療可使患者中位總生存期延長到17個月。此外,在另一項涉及106例Ⅲ-Ⅳ期胰腺癌患者的回顧性研究[15]顯示,熱化療治療組的中位總生存期為18.0個月,非熱療組為10.9個月。當然,還需要進一步的前瞻性隨機對照研究來證實熱化療的有效性與安全性。此外,熱化療的協同作用及其相關分子機制目前尚未完全清楚,因此,本研究探討熱療聯合GEM治療胰腺癌的療效及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與試劑 人胰腺癌細胞株PANC-1購自上海市細胞庫;RPMI-1640培養基(批號:A1049101)、0.25%胰蛋白酶(批號:25200056)、杜氏磷酸緩沖鹽溶液(DPBS)(批號:1419014)購自美國Gibco公司;GEM(批號:G552000)購自法國禮來公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC,批號:T34561)、碘化吡啶(PI)(批號:PA5-16661)、熒光染料DCFH-DA(批號:C2938)購自Beyotime公司;抗特異性蛋白1(Sp1)抗體(批號:PA5-29165)、抗細胞周期蛋白D1(Cyclin D1,批號:MA5-35331)、環氧合酶-2(Cox-2,批號:MA5-27783)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)(批號:PA5-106039)抗體均購自Cell Signaling Technology (CST)公司;MTT試劑盒(批號:12-6696-42)購自美國Sigma公司;Annexin V-FITC(批號:147FI)購自Vazyme生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:將PANC-1懸浮于RPMI-1640培養基中,置于5% CO2、37 ℃細胞孵育箱中培養。

1.2.2 細胞分組與處理:將PANC-1細胞隨機分為對照組(無任何處理)、GEM組(給予GEM)、熱化療組(給予熱療聯合GEM)。將濃度為5、10、20、30 μmol/L GEM分別溶解在RPMI-1640培養基中處理PANC-1細胞,分別作用24、48、72 h,以篩選最佳劑量和持續時間。熱化療組將細胞放在5%加濕 CO2、43 ℃培養箱中孵育1 h,聯合GEM 30 μmol/L處理24 h。此外,為了研究活性氧(ROS)在熱療聯合GEM治療中的作用,在熱療前分別用抗氧化劑NAC(0、20、30、40、50 μmol/L)預處理細胞1 h。

1.2.3 細胞增殖情況檢測:將PANC-1細胞懸液接種于96孔板中,根據不同分組進行相應處理(用熱療預處理60 min或加入指定最終濃度的GEM,并孵育不同時間)后,在每孔中加入 MTT,37 ℃下孵育4 h,用酶標儀檢測吸光度值。

1.2.4 細胞凋亡檢測:采用Annexin V-FITC標記的流式細胞儀分析和DAPI染色技術,評價GEM單用或熱療聯合GEM處理后的細胞凋亡情況。PANC-1細胞按1×106細胞/培養皿接種于直徑10 cm的培養皿中。GEM處理前24 h進行熱療(43 ℃處理1 h),收集細胞前24 h給予GEM(終濃度30 μmol/L)。處理后取出培養上清,清洗保留的細胞,離心以后在200 μl結合緩沖液中重懸,然后與10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI在4 ℃下反應30 min。加入300 μl結合緩沖液,立即使用Cyt Expert軟件,在流式細胞儀上檢測凋亡細胞。將PANC-1細胞在24孔板中培養,每孔中嵌入圓形玻片,根據不同分組進行相應處理后用DAPI染色,在倒置熒光顯微鏡下觀測和拍照。

1.2.5 相關蛋白表達檢測:將PANC-1細胞在PBS中洗滌,并根據說明提取蛋白。用BCA試劑盒定量測定后分離等量蛋白,轉移到PVDF膜。然后用5%脫脂奶粉封閉,并與抗Sp1、Cyclin D1、Bcl-2和Cox-2的一抗在4 ℃下反應過夜。用辣根過氧化物酶偶聯的IgG二抗在室溫下檢測,隨后顯影。

1.2.6 ROS檢測:處理后的細胞用PBS洗滌,用10 μmol/L DCFH-DA溶液在37 ℃下培養約20 min,清洗細胞后在倒置熒光顯微鏡下觀察染色細胞。

2 結 果

2.1 各組細胞增殖情況比較 GEM對PANC-1細胞增殖的抑制作用呈劑量和時間依賴性。30 μmol/L GEM對PANC-1細胞增殖的抑制作用高于其他劑量(均P<0.05)。不同聯合方式的熱化療組細胞存活率顯著低于GEM組(均P<0.05)。在GEM治療前熱療1 h細胞存活率顯著低于GEM與熱療同時1 h和GEM治療后熱療1 h(均P<0.05)。

2.2 各組細胞凋亡情況比較 見圖1、2。DAPI染色顯示,與對照組比較,熱化療組PANC-1細胞凋亡最明顯,GEM組PANC-1細胞凋亡次之。流式細胞術顯示,對照組、GEM組和熱化療組細胞凋亡率分別為(2.17±0.21)%、(9.53±0.49)%、(23.10±1.42)%。與對照組比較,GEM組和熱化療組細胞凋亡率增加,且熱化療組細胞凋亡率高于GEM組(均P<0.05)。

2.3 各組細胞ROS比較 見圖3。與對照組比較,GEM組和熱化療組ROS升高,且熱化療組高于GEM組(均P<0.05)。

圖3 各組細胞ROS比較(熒光染色,×200)

2.4 各組細胞Sp1及其下游蛋白表達水平比較 見圖4。與對照組比較,GEM組和熱化療組Sp1蛋白表達水平降低,且熱化療組低于GEM組(均P<0.05)。與GEM組比較,熱化療組Cox-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。與對照組比較,GEM組和熱化療組Bcl-2蛋白表達水平降低,且熱化療組低于GEM組(均P<0.05)。

圖4 各組細胞Sp1及其下游蛋白電泳結果

2.5 NAC對各組細胞增殖及相關蛋白表達的影響 加入NAC后熱化療組細胞存活率較加入前升高,且30 μmol/L NAC對PANC-1細胞增殖的影響更顯著(均P<0.05)。此外,我們發現使用30 μmol/L NAC顯著恢復了Sp1及其下游Cox-2和Bcl-2蛋白的表達(均P<0.05)。

3 討 論

胰腺癌是目前分化較差的惡性實體瘤之一,由于起病隱匿、早期診斷困難以及對放化療不敏感,一般預后不佳[16]。本研究表明,熱療可以提高GEM對胰腺癌細胞的抑制作用,從而顯著刺激ROS的產生,抑制Sp1及其下游蛋白的表達。

熱療是一種很有潛力的癌癥治療方式,通過加熱到42～43 ℃不僅可以實現對腫瘤細胞的直接殺滅作用,而且可以促進化療藥物的傳遞并提高敏感性。此外,熱療通過延緩放療誘導的癌細胞DNA損傷修復來放大放射治療的效果。熱療可引起一系列廣泛的細胞反應,包括DNA損傷、有氧代謝和熱休克蛋白的誘導。此外,熱療會引發氧化應激,增加ROS的產生[17]。臨床研究[17]表明,熱療作為胰腺癌的姑息性治療方法,可促進腫瘤消退。臨床研究[18-22]也證實了熱療聯合放療、化療對不可切除的局部晚期胰腺癌的治療效果。Jin等[23]研究也表明熱療(42 ℃)通過誘導ROS的產生抑制了SW1990細胞的活力。本研究證實了熱化療聯合對胰腺癌細胞抑制作用最為顯著。此外,與GEM組比較,熱化療組ROS顯著升高。

Sp1屬于Sp/Krtippel轉錄因子家族(SP/KLF家族),由DNA結合區、Sp1區激活區、Btd盒和SP盒四個功能域組成。C端DNA結合區域由三個典型的Cys2-His2鋅指結構組成,與GC盒的高親和力和對CT、GT盒的低親和力密切相關[24]。因此,Sp1的序列特異性DNA結合賦予其對細胞生長、發育、分化和遷移等基因表達的調節作用。研究證實,在具有侵襲、轉移性更高的胰腺癌樣本中Sp1異常過度表達,Sp1高表達與患者更差的臨床分期、腫瘤分級和淋巴結轉移密切相關,同時也意味著患者預后差和極低的5年生存率。本研究中,在GEM組細胞中Sp1表達下降,而在熱化療組Sp1降低更加明顯。同時,熱化療組也下調了Sp1下游Cox-2、Bcl-2蛋白的表達。Sp1可以和許多核因子相互作用,調節基因表達。在胰腺癌細胞中,Sp1通過其N端結構域與轉錄因子活化T細胞核因子C2(NFATc2)的相互作用增加了活化T細胞核因子(NFAT)的活性。Yang等[25]證實了Sp1與YAP1啟動子中的多個位點結合,從而驅動胰腺癌細胞中YAP1的激活。血管內皮生長因子(VEGF)和Cox-2是Sp1的主要靶基因之一,是影響細胞生長、惡性腫瘤發生與發展的關鍵調控因子。Hu等[26]報道了在胰腺癌細胞中,Sp1與Cox-2的表達呈正相關,并且Sp1結合到Cox-2啟動子-245/-240附近的序列位置。本研究也證實,Cox-2在熱化療作用下與Sp1發生了類似的變化。

綜上所述,熱化療通過誘導ROS的產生抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖,促進細胞凋亡,進而抑制Sp1及其下游相關蛋白的表達。本研究可為熱療聯合化療治療胰腺癌提供基礎實驗依據。