環狀RNA circ_0020123靶向調控微小RNA-145影響胰腺癌細胞SW-1990增殖、侵襲與轉移實驗研究

依力哈木·買買提,鐘 鍇,艾合散·卡馬力,楊 鵬,依馬木買買提江·阿布拉

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院,新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆醫科大學第三臨床醫學院肝膽胰外科,新疆 烏魯木齊 830011)

胰腺癌是惡性程度較高的腫瘤,病死率極高[1]。由于早期診斷困難,患者確診時往往已處于中晚期[2]。此外,胰腺癌的發病機制尚不清楚,目前尚無有效的治療方法或藥物。環狀RNA(Circular RNA,circRNA)是具有閉環結構的單鏈RNA,比長鏈非編碼RNA具有更高的細胞穩定性[3]。circRNA通過調節基因表達和干擾癌細胞生物學行為參與多種癌癥的發生和發展[4]。從機制上講,circRNA可以作為競爭性內源性RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA)從微小RNA(microRNA,miRNA)施加的抑制中釋放下游信使RNA(Message RNA,mRNA)。在ceRNA模式中,circRNA通過與miRNA相互作用來調節mRNA表達。有研究[5]發現,circ_0020123在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和肺腺癌細胞中高表達。高水平circ_0020123與NSCLC患者晚期TNM腫瘤分期密切相關。據報道[6],circ_0020123作為ceRNA與miR-144相互作用,上調鋅指E盒結合同源框1(Zinc-finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)和zeste 2抑制復合物2亞基增強子的表達,從而促進NSCLC的進展。此外,circ_0020123作為miR-488-3p的ceRNA可上調金屬蛋白酶解離素9(ADAM9)表達,促進NSCLC的發展[7]。但關于circ_0020123在胰腺癌中作用機制的研究較少。因此,本研究探討circ_0020123通過靶向調控miR-145對胰腺癌細胞增殖、侵襲與轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑 胰腺癌細胞系(SW-1990)購自美國典型培養物保藏中心。Lipofectamine 2000試劑(批號:20220125)、Lipofectamine 3000試劑(批號:20220254)、TRIzol試劑(批號:20220532)、SYBR Green qPCR Mix(批號:20220287)購自德國默克Invitrogen公司;Prime Script First Strand cDNA Synthesis Kit(批號:20220258)購自北京綠源伯德生物科技有限公司;抗基質金屬蛋白酶-9(MMP-9,批號:2205007)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK,批號:221232)、抗三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,批號:ab125247)購自美國Abcam公司;核糖核酸酶R (RNase R,批號:20221014)購自上海玉博生物科技有限公司;RNeasy Min Elute Cleanup Kit(批號:2022145)購自德國QIAGEN公司;雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒(批號:2022521)購自Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:細胞在含有10%胎牛血清、100 IU/ml的10%青霉素和100 μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基中,于37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.2.2 細胞轉染與分組:Sangon合成hsa_circ_0020123剪接形式的短發夾RNA及其對照物、miR-145模擬物及其陰性對照物?？誴cDNA3.1載體和過表達circ_0020123的pcDNA3.1載體購自Gene Pharma公司。根據說明,使用Lipofectamine 2000試劑將上述shRNA(40 nmol/L)、模擬物(50 nmol/L)和載體(10 nmol/L)轉染到SW-1990細胞中。48 h后通過反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢查轉染效率。設置si-NC組、si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組,其中si-NC組轉染hsa_circ_0020123敲低寡聚物的對照物,si-circ_0020123組轉染hsa_circ_0020123敲低寡聚物,si-circ_0020123+anti-miR-145組在轉染hsa_circ_0020123敲低寡聚物的同時轉染敲低表達的miR-145。同時設置miR-145組和miR-NC組,分別轉染miR-145模擬物及其陰性對照物。

1.2.3 RT-qPCR檢測基因表達:采用TRIzol試劑從SW-1990細胞中提取RNA,并合成cDNA。RT-qPCR使用SYBR Green qPCR Mix和ABI系統進行。使用2-ΔΔCt方法計算基因表達。GAPDH和U6作為內參,引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.4 蛋白質印跡(Western blot)檢測蛋白表達:轉染后,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解SW-1990細胞。蛋白質濃度采用BCA法測定。將提取的蛋白質進行電泳,然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上,在脫脂牛奶中室溫封閉2 h。將膜與MMP-9、Bcl-2、p-AMPK(1∶1000稀釋)和GAPDH(1∶2000稀釋)的一抗在4 ℃下孵育過夜。隨后將洗滌膜與二抗在室溫下孵育2 h。蛋白質條帶通過增強的化學發光檢測系統進行可視化,并采用Image J軟件進行分析。GAPDH作為內參。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖:取轉染后的SW-1990細胞接種于96孔板中,置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中培養48 h后,采用全自動熒光酶標儀測定細胞懸液在490 nm波長處的吸光值。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲:將胰腺癌細胞株SW-1990重新懸浮在無血清高糖DMEM培養基中,密度為1×105個/ml,然后將200 μl細胞懸液緩慢加入Transwell上室,在下室加入含10%胎牛血清的600 μl高糖DMEM培養基,在37 ℃培養箱中培養24 h,棉簽擦拭上室內殘留細胞,甲醇固定30 min,0.1%結晶紫染色15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后在顯微鏡下隨機抽取5個視野計數,取平均值作為遷移細胞數。將Matrigel凝膠基質作為侵襲模型,加入細胞懸液,其余操作同細胞遷移實驗。

1.2.7 RT-qPCR檢測circ_0020123水平:總RNA(5 μg)與或不與3 U/μg RNase R在37 ℃下孵育30 min,然后使用RNeasy Min Elute Cleanup Kit純化RNA,最后將RNA轉錄成cDNA,并通過RT-qPCR檢測circ_0020123的表達水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0020123和miR-145的靶向結合:采用Circ Interactome數據庫預測circ_0020123和miR-145的結合區域。合成miR-145的野生型(WT)和突變型(MUT)片段,并分別亞克隆到pmirGLO載體中構建pmirGIO-miR-145-WT/MUT載體。將sh-circ_0020123#1或sh-NC與miR-145-WT/MUT載體共轉染到SW-1990細胞中,同時將NC模擬物(miR-NC組)、miR-145模擬物或miR-145+pcDNA3.1共轉染(miR-145組)。使用Lipofectamine 3000試劑將circ_0020123導入SW-1990細胞。共轉染48 h以后,使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測circ_0020123-WT/MUT的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 各組細胞增殖情況比較 si-NC組、si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組光密度值分別為0.97±0.09、0.48±0.04和0.67±0.07,三組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與si-NC組比較,si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞增殖能力降低(均P<0.05)。與si-circ_0020123組比較,si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞增殖能力提高(P<0.05)。

2.2 各組細胞凋亡率比較 si-NC組、si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組凋亡率分別為(5.18±0.49)%、(18.77±2.59)%和(11.34±1.24)%,三組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與si-NC組比較,si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞凋亡率升高(均P<0.05)。與si-circ_0020123組比較,si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞凋亡率降低(P<0.05)。

2.3 各組細胞侵襲和遷移能力比較 見表2。與si-NC組比較,si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組侵襲細胞數和遷移細胞數降低(均P<0.05)。與si-circ_0020123組比較,si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞侵襲細胞數和遷移細胞數升高(均P<0.05)。

表2 各組細胞侵襲和遷移能力比較(個)

2.4 雙熒光素酶報告實驗結果 見表3。與miR-NC組比較,miR-145組circ_0020123-WT熒光素酶活性降低(P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗結果

2.5 各組細胞MMP-9、Bcl-2、p-AMPK表達水平比較 見表4。與si-NC組比較,si-circ_0020123組和si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞MMP-9、Bcl-2表達水平降低,p-AMPK表達水平升高(均P<0.05)。與si-circ_0020123組比較,si-circ_0020123+anti-miR-145組細胞MMP-9、Bcl-2表達水平升高,p-AMPK表達水平降低(均P<0.05)。

表4 各組細胞MMP-9、Bcl-2、p-AMPK表達水平比較

3 討 論

circRNA最初被認為是RNA剪切過程中的副產物。隨著測序技術和生物信息學分析的發展,異常表達的circRNA與腫瘤發病機制間的關聯越來越受到關注。研究[8]發現,circ_0020123為多種惡性腫瘤的致癌基因。Qu等[6]研究證明,circ_0020123在NSCLC中表達增強,其高表達與腫瘤的侵襲性表型和NSCLC細胞的惡性行為相關。Wan等[7]研究證明,circ_0020123通過介導miR-488-3p/ADAM9軸來促進NSCLC的發展。但circ_0020123在胰腺癌組織中的表達和機制尚不明確。本研究發現circ_0020123被敲低后抑制了胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲并誘導細胞凋亡。

研究[9]表明,circRNA通過充當 miRNA 海綿分子來調節基因表達。與其他ceRNA(如 lncRNA 或假基因)相比,circRNA更傾向于與 miRNA 結合,被稱為“超級海綿”。許多circRNA含有miRNA反應元件和結合位點,因此可能參與癌癥的生長和進展。例如,circ_0004771 被發現可抑制乳腺癌細胞的增殖并加速細胞凋亡,作為miRNA海綿降低miR-653表達,反過來又通過結合ZEB2 mRNA的3’-非翻譯區來靶向間充質標ZEB2基因表達[10]。此外,circAGFG1與三陰性乳腺癌患者的晚期臨床分期、不良預后和病理分級相關,其可能直接靶向miR-195-5p并抑制細胞周期蛋白E1的表達[11]。同樣,研究[12]發現,circ_0000376通過作為miR-384海綿促進NSCLC細胞的增殖、侵襲和耐藥性。研究[13]發現,circ_0078767通過靶向miR-330-3p抑制NSCLC細胞的惡性行為。本研究使用生物信息學數據庫發現,miR-145與circ_0020123具有潛在結合序列。

miR-145被認為是一種腫瘤抑制因子,在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌和骨肉瘤等癌癥中表達下調[14-17]。研究[18]表明,miR-145可促進SW620細胞增殖和增加代謝活性,但其參與癌癥發展主要是通過靶向重要的癌基因并有效抑制它們在不同信號通路中的表達,從而抑制癌細胞增殖、侵襲轉移或增強化療敏感性。研究[19]證實miR-145在轉移性結直腸癌中具有抗癌潛力,其在結腸癌的轉錄后水平負向調節p70S6K1表達。本研究發現,與miR-NC組比較,miR-145組circ_0020123-WT熒光素酶活性降低,提示circ_0020123和miR-145之間存在靶向結合關系。

為了分析circ_0020123沉默是否通過上調其靶標miR-145來抑制胰腺癌細胞的惡性行為,本研究通過用si-circ_0020123單獨或與anti-miR-145一起轉染胰腺癌細胞進行了拯救實驗。沉默miR-145在很大程度上挽救了因沉默circ_0020123導致的胰腺癌細胞增殖的降低。沉默circ_0020123誘導的胰腺癌細胞的遷移和侵襲抑制作用被敲低的miR-145減弱。由沉默circ_0020123導致 MMP-9和Bcl-2蛋白水平的變化在很大程度上被敲低的miR-145所逆轉。p-AMPK水平通過引入anti-miR-145得到部分恢復。這些結果表明,circ_0020123干擾抑制了惡性表型并部分通過上調miR-145觸發胰腺癌細胞的凋亡。miRNA與其靶標mRNA結合后,可以調節mRNA的穩定性和翻譯[20-21]。circ_0020123作為miR-145海綿,可以調控胰腺癌細胞的惡性生物學行為。

綜上所述,circ_0020123通過靶向miR-145可抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲與轉移,而沉默miR-145可逆轉上述作用。