桃葉珊瑚苷對膝骨關節炎小鼠的作用及機制實驗研究

夏紅麗,田俊斌,李治琴

(1.西安市第三醫院,陜西 西安 710021;2.西安交通大學第二附屬醫院,陜西 西安 710004)

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)是老年患者殘疾的重要原因,嚴重降低了患者的生活質量[1]。自噬是維持細胞內環境穩態的重要途徑[2]。研究[3]發現,補腎調肝方含藥血清增強軟骨細胞自噬能力,延緩大鼠關節軟骨退變,起到治療KOA的作用。研究[4]表明,激活自噬可在一定程度上延緩KOA進展。桃葉珊瑚苷是環烯醚萜苷類化合物,杜仲所含天然活性成分之一。研究[5]表明,桃葉珊瑚苷可通過誘導自噬抑制成骨細胞凋亡。研究[6]發現,桃葉珊瑚苷可在體外抑制白細胞介素(Interleukin,IL)-1β誘導的軟骨細胞凋亡,在體內延緩KOA小鼠病程進展。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol 3-kinases/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信號通路是細胞自噬的重要信號轉導通路。研究[7]表明,PI3K/AKT/mTOR信號通路在KOA大鼠軟骨組織中異常活化,續斷總皂苷通過抑制該信號通路上調軟骨細胞自噬水平,延緩KOA進展。但關于桃葉珊瑚苷能否通過調節軟骨細胞自噬改善KOA的相關報道較少。因此,本研究探討桃葉珊瑚苷對KOA小鼠的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57小鼠50只,7周齡,體重(22±2)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,生產許可證號:SCXK(滬)2017-0005。所有小鼠飼養于溫度(23±2)℃、空氣濕度50%～60%、12 h明暗交替的環境中,自由進食和飲水。

1.2 主要試劑 桃葉珊瑚苷(批號:SA9840,純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司);PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑740Y-P(批號:S80211,上海源葉生物科技有限公司);IL-6檢測試劑盒(批號:PI326,上海碧云天生物科技有限公司);IL-1β檢測試劑盒(批號:BMS6002,北京諾為生物);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(批號:SPS-31517,上海賽培森生物科技有限公司);自噬相關蛋白(Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ)及p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH抗體(批號:ab108327、ab303488、ab207612、ab192890、ab278545、ab302958、ab38449、ab8805、ab109268、ab134903、ab8245,美國Abcam公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備:將50只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、桃葉珊瑚苷組、激動劑組、桃葉珊瑚苷+激動劑組,每組10只。除正常對照組外,其余組小鼠根據改良的Hulth法[8]建立KOA模型。小鼠腹腔麻醉,縱行切開右后肢膝關節部位皮膚,暴露膝關節,離斷前、后交叉韌帶和內側副韌帶,打開關節腔,切除內側2/3半月板,止血后逐層縫合。正常對照組小鼠采用同樣的操作暴露關節腔,不離斷前、后交叉韌帶和內側副韌帶,不切除半月板。術后肌注青霉素抗感染。

1.3.2 給藥與取材:造模后第2天,桃葉珊瑚苷組80 mg/kg[6]桃葉珊瑚苷灌胃,1次/d,連續12周;激動劑組腹腔注射740Y-P 0.5 μmol/kg[9],1次/d,連續12周;桃葉珊瑚苷+激動劑組80 mg/kg桃葉珊瑚苷灌胃,同時0.5 μmol/kg 740Y-P腹腔注射,1次/d,連續12周;正常對照組和模型組小鼠分別灌胃和腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續12周。于末次給藥2 h后處死小鼠,采集右后肢膝關節軟骨組織,分成4份,其中1份進行乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣處理4周,4%多聚甲醛固定,其余3份置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 HE染色:取經4%多聚甲醛固定后組織,經脫水、包埋、石蠟切片、伊紅染液染色、雙蒸水沖洗、蘇木素染液染色、雙蒸水清洗、中性樹膠封片后,于顯微鏡下觀察小鼠膝關節組織病理形態學變化,并進行Mankin評分。其中,軟骨表面損傷計0～6分,細胞喪失計0～3分,基質染色喪失計0～4分,潮線喪失計0～1分,分值越高表明病變越嚴重[10]。

1.3.4 番紅O-固綠染色:取石蠟切片,嚴格按照試劑盒說明書進行染色。

1.3.5 軟骨組織炎癥因子水平檢測:取凍存的軟骨組織,剪碎,勻漿后3000 r/min離心10 min,取上清液,嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.3.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測自噬相關基因、PI3K、AKT和mTOR mRNA水平:取凍存的軟骨組織,剪碎,勻漿后采用TRIzol試劑提取組織RNA,反轉錄成cDNA,以cDNA為模板行PCR反應。以GAPDH為內參,引物由廣州銳博生物科技有限公司合成,序列見表1。以2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平。

表1 各基因引物序列

1.3.7 蛋白印跡法檢測自噬相關蛋白、LC3 Ⅱ/Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平:取凍存的軟骨組織,剪碎,勻漿,裂解,BCA法測定蛋白濃度。蛋白電泳分離,取下分離膠,將分離膠上的蛋白濕轉至PVDF膜,TBST洗滌,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入相關抗體(均1∶1000稀釋),4 ℃孵育過夜,加入相關二抗(均1∶5000稀釋)室溫孵育,顯色后采用Image J分析條帶灰度值。

2 結 果

2.1 小鼠膝關節軟骨組織染色結果及Mankin評分比較 見表2(圖1)。染色結果顯示:與正常對照組比較,模型組關節軟骨表面粗糙,細胞結構層次混亂,數量減少,潮線排列破壞嚴重;激動劑組軟骨組織病變程度更重;桃葉珊瑚苷+激動劑組小鼠關節軟骨表面稍光滑,細胞排列相對整齊,數量稍減少,潮線受損程度減輕;桃葉珊瑚苷組軟骨組織病變程度明顯改善。統計學分析顯示:與正常對照組比較,模型組Mankin評分升高(P<0.05);與模型組比較,桃葉珊瑚苷組Mankin評分降低(P<0.05);與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Mankin評分升高(P<0.05);與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Mankin評分降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠Mankin評分比較(分)

2.2 各組小鼠軟骨組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較 見表3。與正常對照組比較,模型組IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,桃葉珊瑚苷組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(均P<0.05)。與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(均P<0.05)。與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(均P<0.05)。

表3 各組小鼠軟骨組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較(ng/L)

2.3 各組小鼠軟骨組織自噬相關基因、PI3K、AKT和mTOR mRNA水平比較 見表4。與正常對照組比較,模型組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA降低,PI3K、AKT、mTOR mRNA水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,桃葉珊瑚苷組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA升高,PI3K、AKT、mTOR mRNA降低(均P<0.05)。與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA降低,PI3K、AKT和mTOR mRNA升高(均P<0.05)。與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1、LC3 mRNA升高,PI3K、AKT和mTOR mRNA降低(均P<0.05)。

表4 各組小鼠軟骨組織自噬相關基因、PI3K、AKT和mTOR mRNA水平比較

2.4 各組小鼠軟骨組織自噬相關蛋白、LC3 Ⅱ/Ⅰ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平比較 見表5。與正常對照組比較,模型組Atg5、Atg12、Baclin-1蛋白水平以及LC3 Ⅱ/Ⅰ降低,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,桃葉珊瑚苷組Atg5、Atg12、Baclin-1蛋白水平和LC3 Ⅱ/Ⅰ升高,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR 蛋白水平降低,而激動劑組與之相反(均P<0.05)。與桃葉珊瑚苷組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1蛋白水平和LC3 Ⅱ/Ⅰ降低,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平升高(均P<0.05)。與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ升高,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平降低(均P<0.05)。

表5 各組小鼠軟骨組織自噬相關蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平比較

3 討 論

隨著病程進展,骨關節炎患者常出現關節軟骨退化,伴邊緣骨贅形成,好發于膝、髖、頸椎和腰椎等負重關節,主要臨床表現為關節疼痛、僵硬、肥大和活動受限。臨床上主要通過非甾體類抗炎藥、透明質酸鈉、基質金屬蛋白酶抑制劑或聯合用藥等藥物治療,或采用針灸推拿、正骨治療等非藥物治療。但以上治療只能緩解骨關節炎患者臨床癥狀,延緩病情進展,不能完全根治[11]。因此,尋找有效治療骨關節炎的新藥物具有重要的臨床意義。桃葉珊瑚苷具有廣泛的藥理學活性。研究[12]發現,桃葉珊瑚苷通過抑制心肌細胞凋亡發揮抗心肌缺血損傷的作用,從而改善急性心肌梗死小鼠心功能障礙。梅凡等[13]研究表明,桃葉珊瑚苷可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。但關于桃葉珊瑚苷能否通過調節軟骨細胞自噬改善KOA的相關報道較少,因此本研究探討桃葉珊瑚苷對KOA小鼠的作用及機制。

本研究結果顯示,KOA小鼠膝關節軟骨表面粗糙,細胞結構層次混亂、數量減少,潮線排列破壞嚴重。桃葉珊瑚苷組小鼠膝關節軟骨組織病變程度明顯改善。模型組小鼠Mankin評分高于正常對照組,桃葉珊瑚苷組小鼠評分低于模型組。KOA患者常存在炎癥反應損傷[14]。因此,本研究檢測了軟骨組織炎癥因子水平,結果顯示桃葉珊瑚苷可降低軟骨組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。以上結果表明桃葉珊瑚苷可保護KOA小鼠軟骨退變,降低膝關節炎癥反應。為進一步明確桃葉珊瑚苷的作用機制,本研究采用PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑進行干預,結果顯示桃葉珊瑚苷+激動劑組小鼠關節軟骨病理損傷程度較激動劑組減輕,炎癥因子水平較激動劑組降低,表明桃葉珊瑚苷可拮抗PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑對KOA小鼠膝關節軟骨的損傷作用。自噬被認為是影響KOA發生、發展的重要機制[15]。研究[16]表明,自噬可能通過抑制軟骨細胞焦亡和改善軟骨下骨重塑來延緩小鼠KOA的病理進展。Li等[17]研究表明,青蒿素通過激活細胞自噬水平減緩KOA小鼠進程。本研究結果表明,桃葉珊瑚苷可誘導自噬相關基因Atg5、Atg12、Baclin-1 mRNA和蛋白水平表達,同時LC3 mRNA和LC3 Ⅱ/Ⅰ升高,表明桃葉珊瑚苷可以促進KOA小鼠膝關節軟骨細胞自噬。

研究[18-19]發現,PI3K/AKT/mTOR信號通路參與細胞增殖、凋亡等過程,且與炎癥性疾病密切相關。激活PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制自噬過程[20]。本研究結果顯示,模型組PI3K/AKT/mTOR信號通路異常激活,桃葉珊瑚苷可抑制信號通路中各蛋白活化。而桃葉珊瑚苷+激動劑組信號通路活性低于激動劑組,表明桃葉珊瑚苷可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路異常激活。通過檢測自噬相關基因發現,激動劑組Atg5、Atg12、Baclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ較模型組降低,而與激動劑組比較,桃葉珊瑚苷+激動劑組以上指標升高,表明激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制細胞自噬水平,而桃葉珊瑚苷可拮抗PI3K/AKT/mTOR信號通路激動劑對自噬的影響。

綜上所述,桃葉珊瑚苷可改善KOA小鼠膝關節軟骨病變,減輕炎癥反應,其機制可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導軟骨細胞自噬。