pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物功能和結構特性的影響

安悅嘉，曹雪妍，楊 梅，陶冬冰，張 旋，張 琦，潘 松，岳喜慶

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

酪蛋白是十分重要的優質蛋白，其必需氨基酸含量較高，且比例適中，種類齊全，在人體發育成長的過程中必不可少。木糖醇是糖尿病患者不可或缺的糖代品，其生物利用、醫學輔助治療預防方面都十分優質，大眾需求不斷提高。

酪蛋白的功能性質在食品加工中具有不可或缺的作用。酪蛋白較好的乳化性可提高脂肪乳化程度，常用于脂肪含量較高的蛋糕及咖啡伴侶中。較好的起泡性因可以形成穩定膜使酪蛋白被用作泡沫穩定劑，應用于人造奶油中。但酪蛋白的溶解性較差，難以在室溫條件與其他緩沖液相融，導致其在食品加工行業的發展和利用中受到了阻礙[1]。pH 值是改變蛋白質溶解性較為重要的因素，尤其當pH 值接近酪蛋白等電點會對酪蛋白溶解性產生較大影響[2]，且pH 值也會改變蛋白質的分子構象，結構的改變往往會帶動其功能性質的變化。而木糖醇可以提高和改善酪蛋白的乳化穩定性、起泡能力、起泡穩定性及結構特性，尤其是可以改善酪蛋白較差的溶解性[3]。

以解決酪蛋白自身較差的溶解性為基礎前提，利用圓二色光譜、熒光光譜、紫外分光光度等方法研究了不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物二級結構、三級結構及表面疏水性、乳化性、起泡性、溶解性的影響。以便選取最適宜的環境條件及加工技術，更好地對復合物進行加工及利用，對酪蛋白與木糖醇在乳制品、功能性食品的添加及研發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

酪蛋白（蛋白質含量≥95.0 %，相對分子質量為50 000～375 000）、木糖醇（純度＞99%，相對分子質量為152.1），北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供。

F-4600 型熒光光譜儀，日立公司產品；RH basic2 型磁力攪拌器，廣州科儀公司產品；Cary 50 型紫外- 可見分光光度計，美國VARIAN 公司產品；DK-S26 型數顯電子恒溫水浴鍋，上海精宏公司產品；T18 basic 型高速分散器，德國IKA 公司產品；pHS-25 型數顯pH 計，上海精密科儀公司產品；J-810 型圓二色譜儀，日本Jasco 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 預處理方法

將酪蛋白粉末與木糖醇顆粒按照濃度比為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 稱取并混合，再溶解于體積比為1∶1 的0.1 mol/L NaOH 溶液和0.05 mol/L 的Tris-HCl 溶液緩沖液中，置于50 ℃的水浴鍋中待沉淀完全溶解后，置于磁力攪拌器中攪拌[4]。測定在中性pH 值室溫25 ℃條件下，不同濃度配比對酪蛋白- 木糖醇復合物表面疏水性、起泡性、乳化性及溶解性的影響。選擇復合物溶解性最好的濃度配比1∶1，并將接下來的試驗設定酪蛋白與木糖醇濃度為1∶1，pH 值的范圍設定為3，4，5，6，7，8，9，10，11。

1.2.2 表面疏水性的測定

將不同pH 值的酪蛋白- 木糖醇復合物溶液樣品用緩沖溶液稀釋適當倍數后分別加入25 μL 的ANS探針溶液，振蕩均勻并放于室溫下避光靜置5 min。以樣品緩沖溶液為對照，采用日立F-4600 型熒光分光光度計，激發波長為390 nm，發射波長為470 nm，激發和發射狹縫寬均為5 nm 條件下，測定樣品的熒光強度[5]。

1.2.3 起泡性的測定

分別取適量酪蛋白- 木糖醇復合物于高速分散器以轉速10 000 r/min 均質60 s，迅速記錄泡沫體積即為初始泡沫體積。靜置30 min 后再次計算泡沫體積，基于以下公式計算起泡性（FAI，%） 以及起泡穩定性（FSI，%）[6]：

式中：V——樣品溶液的體積，mL；

V0——均質后即刻記錄的樣品初始泡沫體積，mL；

V30——靜置30min 后記錄的樣品泡沫體積，mL。

1.2.4 溶解性的測定

采用考馬斯亮藍法，分別將酪蛋白- 木糖醇復合物溶液以轉速8 000 r/min 離心20 min，取出1 mL的上清液稀釋10 倍或100 倍，滴加5 mL 考馬斯亮藍溶液，避光10 min，于波長595 nm 處測定樣品的吸光度，根據牛血清白蛋白標準曲線計算上清液中蛋白質含量，再根據以下公式計算溶解性（%）：

1.2.5 乳化性的測定

將酪蛋白- 木糖醇復合物溶液與食用大豆油以3∶1 的比例混合，用高速分散器以轉速10 000 r/min均質60 s，從乳化液即離心管底部吸取50 μL 的混濁液，立即用質量分數為0.1%的SDS 溶液稀釋適當倍數后振蕩均勻，分別在0 min 和10 min 時用紫外分光光度計測定樣品在500 nm 波長處的吸光度，以SDS 為空白對照。根據下式計算乳化活性（EAI，m2/g） 和乳化穩定性（ESI，min）[7]：

式中:C——蛋白質質量，g；

φ——油相體積分數，%；

T=2.303；

DF——稀釋因子；

θ——油相體積分數（0.25），%；

A0——0 min 時吸光度；

A10——10 min 時吸光度。

1.2.6 內源熒光光譜的測定

將處于不同pH 值的酪蛋白- 木糖醇復合物溶液樣品稀釋10 倍后加入ANS 熒光探針溶液，搖晃均勻，在避光的條件下反應5 min，以緩沖溶液（NaOH+Tris-HC）l 作為空白對照。激發波長為280 nm，激發和發射狹縫均為5 nm，掃描發射波長范圍為300～450 nm 的熒光光譜。

1.2.7 圓二色譜（CD） 分析

用圓二色譜儀在25 ℃條件下測定樣品在遠紫外區域（190～250 nm） 的CD 光譜，以樣品的緩沖溶液（NaOH+Tris-HCl） 為空白對照，比色皿的光徑為0.1 cm，測定遠紫外區的CD 光譜。掃描速率為100 nm/min，Data Fitch 為1.0 nm，Band Width 為2.0 nm，掃描3 次，取平均值得到最終的CD 光譜。使用帶有selcon3 算法的CDpro 軟件來計算蛋白質二級結構的組成和含量。

2 結果與分析

2.1 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物表面疏水性的影響

不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物表面疏水性的影響見圖1。

當pH 值在酪蛋白等電點附近時，其疏水性產生了明顯的下降。可能是由于復合物溶液在等電點附近形成明顯聚集沉降，疏水基團被沉降大多包在沉淀內部，使ANS 探針與位點的結合數量降低[8]。當pH 值逐漸增大，復合物疏水性也隨之增大。由于木糖醇能夠增加酪蛋白于等電點附近所帶的電荷數，有效防止酪蛋白分子的相互作用及出現明顯集聚，增強酪蛋白分子的結構穩定。

2.2 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物起泡活性的影響

不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物起泡活性的影響見圖2。

當pH 值處于等電點左右時，酪蛋白- 木糖醇復合物具有較差的起泡能力。由于此時酪蛋白的疏水性降低，影響了酪蛋白分子在水與空氣兩相的結合與吸收，溶液表面張力減小。當pH 值增大，酪蛋白- 木糖醇的起泡能力提高。由于酪蛋白分子結構變得松散，柔性增加，促進了酪蛋白分子在水與空氣兩相的快速吸收和結構展開[9]。

2.3 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物起泡穩定性的影響

不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物起泡穩定性的影響見圖3。

當pH 值為4 左右時，降低了復合物溶液的起泡穩定性。由于酪蛋白的疏水性因pH 值的影響降低，其柔性也因溶液中產生了絮狀沉淀物而降低，使蛋白質分子在水和空氣兩相之間形成膜狀結構的能力降低。當pH 值逐漸增大，復合物的起泡穩定性增強。由于逐漸遞增的疏水性及疏松的分子內部結構使酪蛋白分子可以逐漸在水和空氣兩相形成綿密的泡沫，普拉長邊界的數量增加[10]。

2.4 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物溶解性的影響

不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物溶解性的影響見圖4。

圖4 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物溶解性的影響

當pH 值為4 左右時，復合物的溶解性降低。由于酪蛋白分子所附的靜電荷數可忽略不計，所以靜電斥力也基本消失[11]。但當pH 值增加或降低時，復合物溶液的溶解度顯著增加。酪蛋白分子之間的靜電斥力因其正負電荷而提高，防止蛋白質發生沉降。

2.5 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物乳化活性的影響

不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物乳化活性的影響見圖5。

圖5 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物乳化活性的影響

當pH 值靠近等電點，復合物的乳化活性降低。由于酪蛋白自身的水合作用及靜電斥力均受到不良影響，使酪蛋白表現為微溶的狀態。同時，酪蛋白分子向油- 水界面的擴散，此時較低的溶解性受到影響，降低了其界面張力[12]。當pH 值增加或降低時，復合物的乳化活性增加。由于復合物的溶解性增加，酪蛋白分子與油和水兩相之間的相互作用隨之加大，使界面張力減小。

2.6 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物乳化穩定性的影響

不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物乳化穩定性的影響見圖6。

圖6 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物乳化穩定性的影響

當pH 值為5 時，降低了復合物的乳化穩定性。由于增加的復合物乳液分子相互作用表明其分子所帶電荷數量可能偏低，使復合物溶液產生沉降。但當pH 值遠離等電點，復合物溶液的乳化穩定性顯著增加。可以說明酪蛋白的水合作用及靜電斥力是由于所帶電荷數量的變多而增加的。油—水界面的能量降低，避免溶液產生集聚[13]。

2.7 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物內源熒光發射光譜的影響

不同pH 值條件下的酪蛋白- 木糖醇復合物內源熒光發射光譜見圖7。

圖7 不同pH 值條件下的酪蛋白- 木糖醇復合物內源熒光發射光譜

由圖7 可知，當pH 值為4 時，樣品的內源熒光光譜λmax與pH 值為3 時的樣品相對比減小到348 nm，出現了少量的藍移，與此同時，內源熒光值大幅度降低。可能是因為pH 值為4 左右時，酪蛋白分子之間的靜電相互作用因其表面所帶電荷數的增加而增大。溶液中形成明顯的絮凝沉降，因其環境中的極性大幅度降低而減少了芳香族氨基酸殘基的暴露數量[14]。當pH 值為7 時，樣品的內源熒光光譜λmax值增加為354 nm，產生了紅移，并且其內源熒光值也照樣品pH 值為4 時大幅度增加。當pH 值繼續逐漸增加至堿性條件下時，內源熒光值則沒有較明顯的變化。

2.8 不同pH 值對酪蛋白- 木糖醇復合物遠紫外圓二色光譜的影響

不同pH 值條件下的酪蛋白- 木糖醇復合物遠紫外圓二色光譜見圖8。

圖8 不同pH 值條件下的酪蛋白- 木糖醇復合物遠紫外圓二色光譜

由圖8 可知，pH 值為6～10 時的樣品圓二色譜的負吸收峰出現在210～230 nm，而pH 值為4 時，該樣品的圓二色譜負吸收峰出現在190～210 nm 內。pH 值在6 附近時，酪蛋白具有緊密的分子結構，與堿性條件下的分子結構相差無異。當pH 值降低到酪蛋白等電點附近時，樣品的圓二色譜負吸收峰的位置產生明顯藍移，說明此時酪蛋白分子中α- 螺旋結構的數量明顯降低。當pH 值為10 時酪蛋白結構中α- 螺旋相對較多。

不同pH 值條件下的酪蛋白- 木糖醇復合物二級結構含量分析見表1。

表1 不同pH 值條件下的酪蛋白- 木糖醇復合物二級結構含量分析/%

由表1 可知，pH 值由10 降低到4，酪蛋白分子的α- 螺旋結構從56.28%降低到21.44%，說明酪蛋白分子表面的氨基酸等質子化態會隨著環境中的pH值的變化而發生改變，致使其結構中的α- 螺旋也隨之明顯改變[16]。與此同時，當pH 值為4 時的酪蛋白結構中β- 折疊、β- 轉角及無規卷曲均出現相較于遠離等電點條件而言明顯增大。蛋白質分子的結構會由于結構中的無序轉角及無規則卷曲結構數量的增多而變得松散，但因其表面所吸附的電荷量偏少，所以會在溶液中形成明顯的絮凝沉淀物。

3 結論

當pH 值臨近酪蛋白等電點4.6 時，酪蛋白與木糖醇復合物的功能特性（溶解性、乳化性、起泡性、疏水性） 均較差。復合物內源熒光值大幅度降低。分子結構穩定性較差。當pH 值遠離等電點時，酪蛋白與木糖醇復合物的功能特性（溶解性、乳化性、起泡性、疏水性） 均顯著提高。內源熒光值明顯升高。分子結構穩定性較好。

在生產和加工含有酪蛋白- 木糖醇復合物的食品的過程中，應避免環境pH 值臨近酪蛋白等電點，趨于中性或弱堿性的pH 值環境較好。