豬圓環病毒2 型分離鑒定與致病性研究

●謝春賢

（甘肅省嘉峪關市畜牧技術推廣站 甘肅 嘉峪關 735100）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）為單股負鏈環狀DNA 病毒，是直徑為17 nm 的圓形小病毒粒子，呈20 面體對稱，沒有囊膜，同時該病毒被認為是目前已知能在哺乳動物細胞中自行復制的最小病毒。現已發現了4 個型，即PCV-1、PCV-2、PCV-3 和PCV-4，其中PCV-2的致病性較高，患病后的仔豬表現為多系統衰竭綜合征，一般會出現生長發育遲緩，身體逐漸消瘦，呼吸困難，精神萎靡，皮毛雜亂，食欲減退等癥狀，而且PCV-2 容易與其他病毒共同侵害仔豬，出現混合感染，使病情加重，增加治療難度[1-4]。豬感染PCV-2 后可引起免疫抑制，使機體免疫力下降，在生豬養殖領域中流行較廣，威脅不同、年齡不同品種的豬，其中對斷乳仔豬、育成豬和繁殖母豬威脅最為嚴重，給養殖戶造成巨大的經濟損失[5-6]。目前，我國基層養豬業的發展規模不斷擴大，PCV-2 的發生頻率也不斷提高，嚴重威脅到了我國基層養殖產業的健康發展。通過對豬圓環病毒2 型（PCV-2）的分離鑒定與致病性進行研究，可為PCV-2 的診斷和預防提供指導，以便做好PCV-2 的防控工作。

1 材料與方法

1.1 病料來源2023年2 月，采集疑似豬圓環病毒2 型感染的病死豬的淋巴結和脾臟等病料組織5 份。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒的PCR 鑒定根據GenBank 中發布的PCV-2 基因序列設計的PCV-2 型鑒定引物F1：5'-ACCGTTACCGCTGGAGAAGGAA-'3；F2：5'-TGGTTACACGGATATTGTAGTCCTG-3'；引物大小為549 bp。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。將病料組織按照1∶5 的比例加入無菌PBS 進行研磨后， 取組織懸液進行分離上清液（10 000 r/min 離心5 min），過濾除菌，采用病毒DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，以提取基因組DNA 為模板進行PCR 鑒定。

1.2.2 病毒的分離與培養將PK-15 細胞從液氮中取出室溫復蘇，在無菌條件下在24 孔板中加入DMEM 培養液（含10%胎牛血清），在37℃5%CO2培養箱中進行培養。取PCR 鑒定陽性的病料組織，按照1∶5 的比例加入無菌PBS 進行研磨，在-80℃條件下反復凍融3 次，取組織懸液進行分離上清液（10 000 r/min 離心5 min），過濾除菌（0.22 nm 的濾器）。當PK-15 細胞單層長到85%時，棄DMEM 培養液，用DMEM 培養液洗滌3 次，按照1∶100 比例加入上清液（病毒液），在37℃ 5%CO2培養箱中吸附1 h 后加入DMEM培養液（含10%胎牛血清），在37℃ 5%CO2培養箱中繼續培養24～48 h，盲傳10 代后，收取細胞在-80℃條件下保存，提取基因組DNA，用PCV-2 型鑒定引物進行PCR 鑒定。

1.2.3 間接免疫熒光試驗檢測將PK-15 細胞在無菌條件下接種于24 孔板中，加入DMEM 培養液（含10%胎牛血清），在37℃ 5%CO2培養箱中培養至65%，將PCR 鑒定為PCV-2 陽性的盲傳10 代病毒液，按照上述方法接種到24 孔板中吸附1 h，同時設立空白對照孔，DMEM 培養液（含10%胎牛血清）在37℃ 5%CO2培養箱中培養48 h，進行間接免疫熒光試驗檢測。

1.2.4 病毒的TCID50 的測定將PK-15 細胞在無菌條件下在接種于24 孔板中,加入DMEM 培養液（含10%胎牛血清），在37℃ 5%CO2培養箱中培養至85%，將間接免疫熒光試驗為陽性的病毒液在-80℃條件下反復凍融3 次，離心取上清液（1000 r/min，10 min）并進行10 倍梯度稀釋，分別接種于PK-15 細胞，每個稀釋度接種10 個重復，同時設立對照組，培養48 h 后進行間接免疫熒光檢測，采用Karber 法計算HLC1 株的TCID50[8]。

1.2.5 動物人工感染試驗將10 頭8 日齡、體重相近的三元雜交仔豬分成2 組，每組5 頭。每頭仔豬通過肌肉注射的方法攻毒盲傳10 代病毒液2 mL，劑量為4.12×107TCID50/頭，對照組給予等量的PBS。觀察每個試驗組仔豬的發病情況，采集病死仔豬的病料組織，采用PCR 方法和間接免疫熒光試驗進行PCV-2 鑒定[9]。

2 結果與分析

2.1 病毒的PCR 鑒定結果由圖1 可知，從采集的病料組織中擴增到約為549 bp 的目的片段，說明采集疑似豬圓環病毒2 型的病死豬的病料組織中含有PCV-2。

圖1 淋巴結和肺臟組織PCR 擴增結果

2.2 病毒的分離與培養

由圖2可知，從盲傳10代的細胞培養物中擴增到約為549 bp 的目的片段。與預期一致，通過測序分析，確定分離毒株為PCV-2，命名為HLC1株。

圖2 淋巴結和肺臟組織PCR 擴增結果

2.3 間接免疫熒光試驗檢測

由圖3 可知，感組PCV-2 陽性的盲傳10 代病毒液的 PK-15 細胞可觀察到特異性綠色熒光，對照組的PK-15 細胞未見特異性熒光。

圖3 接免疫熒光試驗檢測

2.4 病毒的TCID50 的測定結果

采用 Karber 法計算HLC1 株的TCID50，結果顯示，HLC1 株的TCID50為4.12×107TCID50/0.1 mL。

2.5 動物人工感染試驗結果

攻毒組的仔豬在攻毒后的3～6 d 出現精神沉郁、采食量減少，被毛粗亂、個別身上出現小紅點，其中3 頭仔豬在攻毒后的5 d 出現死亡，死亡率為60%。對死亡仔豬進行剖檢，可見肺臟、脾臟及淋巴結出現不同程度的病理變化。采集死亡仔豬病料組織，采用PCR 方法和間接免疫熒光試驗鑒定PCV-2 為陽性，對照組的仔豬未出現明顯臨床癥狀，說明分離的HLC1 株對仔豬具有致病性。

3 討論

豬圓環病毒對養豬業的危害比較大，尤其是我國PCV2 感染率居高不下，給養殖戶造成了巨大的經濟損失，臨床中PCV-2 單獨感染一般不會引起豬發生典型的臨床癥狀，尤其PCV 與豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒病病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬附紅細胞體、豬副豬嗜血桿菌病等病毒發生混合感染后，將導致感染豬出現嚴重的臨床癥狀[2-5]。PCV-2 的感染能誘導產生免疫抑制并損害免疫系統，造成免疫功能紊亂，給養豬業造成嚴重的經濟損失[10]。因此，在仔豬的日常的養殖工作中，要定期接種PCV-2 疫苗，降低PCV-2 對仔豬群的不利影響，同時加強飼養管理，減少該病的發生與流行概率。

4 結論

試驗從疑似豬圓環病毒2 型感染的病死豬的淋巴結和脾臟等病料組織中分離得到了1 株PCV-2 分離毒株，命名為HLC1 株，其TCID50為4.12×107TCID50/0.1 mL，分離的PCV-2 HLC1 株毒株對28 日齡仔豬具有致病性。HLC1 株分離為PCV-2 疫苗的制備奠定了良好基礎。