基于分子對接技術與實驗驗證探究熟地鎖陽方治療特發性肺纖維化的療效及其作用靶點*

張 寧，郭亞麗，彭艷茹，王玉光

（1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一類慢性、進行性加重的纖維化性間質性肺疾病，普通型間質性肺炎是其典型的組織病理學表現。IPF以慢性咳嗽、漸進性呼吸困難或活動后氣喘等為主要臨床表現[1]。IPF病因及發病機制未明，多種促炎及促纖維化因子參與本病的發生發展；其中持續性肌成纖維細胞表型可引起細胞外基質過度沉積和肺組織的異常修復，最終可導致肺組織瘢痕形成、肺泡結構扭曲和肺功能不可逆轉的喪失[2]。相關報道顯示[3]，在體檢人群中IPF的檢出率約為5.52%，而且男性的患病率高于女性。IPF目前仍缺乏有效的治療藥物，雖然抗纖維化藥物吡非尼酮、尼達尼布可延緩疾病的進展，但不能改善患者咳嗽、喘息、疲乏等臨床癥狀，同時存在一定的不良反應，如惡心嘔吐等胃腸道癥狀、皮膚光過敏、肝功能異常等，使部分患者難以接受[4]。

從中醫學來講，IPF屬于“肺痿”等范疇。多數醫家認為本病的病機為本虛標實，其中肺腎虧虛是IPF的發病基礎[5]。因本病的病位、病機及臨床癥狀均與腎關系密切，故現代醫家學者在治療IPF時，強調從腎論治[6-7]。Mate分析結果顯示，應用補腎法治療間質性肺疾病可改善患者咳嗽、喘息等臨床癥狀，未見嚴重不良反應，安全性可靠[8]。本課題組自擬熟地鎖陽方治療IPF，前期臨床觀察發現該方可改善患者咳嗽、疲乏無力等癥狀，但其作用機制尚不明確。中藥復方具有多種有效成分，同時其成分也作用于諸多靶點，故其治療疾病的作用機制十分復雜。應用計算機模擬的分子對接技術，可以從微觀的分子角度闡釋藥物有效化合成分與疾病靶點的結合機制，從而有利于探究中藥復方干預疾病的作用機制，而且在一定程度上縮短了研究周期，降低了研究費用[9-10]。故本研究擬采用分子對接技術結合網絡藥理學，將熟地鎖陽方中有效化合物和疾病相關靶點進行模擬對接，并通過體內動物實驗進行驗證，從而對熟地鎖陽方治療IPF的療效及其作用靶點進行探究。

1 材料與方法

1.1 有效化合物與靶點篩選及分子對接

1.1.1 熟地鎖陽方中有效化合物的收集與篩選 應用TCMSP及BATMAN-TCM數據庫收集熟地鎖陽方的有效化合物。應用Cytoscape 3.8.0中的CytoNCA軟件，通過Degree進行評分，由高到低排序后，選取Degree較高的有效化合物作為小分子配體，進行后續的分子對接。

1.1.2 “藥物-疾病”潛在作用靶點的選取 應用TCMSP數據庫及相關文獻查找熟地鎖陽方中化合物所作用的靶點。以“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”為關鍵詞，分別從GeneCards、PharmGkb、OMIM、DrugBank及TTD數據庫對IPF潛在致病靶點基因進行搜索。各個數據庫結果取并集，同時刪除重復的靶基因。

將藥物作用靶點與疾病作用靶點取交集后，導入STRING數據庫，構建蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡圖。然后將PPI網絡圖相關信息導入Cytoscape 3.8.0軟件，利用此軟件中CytoNCA進行拓撲分析，從而對靶點進一步篩選，獲得核心作用靶點。主要依據中間值（BC）、貼近度中心度（CC）、度中心度（DC）、特征向量中心度（EC）、局部平均連接基方法（LAC）和網絡中心度（NC）來篩選核心靶點，這些值大于或等于中值[11]。結合所獲得的核心作用靶點及相關文獻，選取相關的靶點作為大分子受體，進行分子對接。

1.1.3 分子對接預測熟地鎖陽方干預IPF的可能作用靶點 從PubChem數據庫下載熟地鎖陽方潛在活性成分的小分子配體2D結構，通過應用ChemOffice軟件將其2D結構轉化為3D結構。從PDB數據庫下載核心靶點基因的大分子蛋白受體，Pymol軟件去除蛋白結構中的水分子及小分子配體，并導入AutoDock－Tools進行加氫等預處理。應用Vina軟件對受體和配體進行分子對接，分析其結合活性。

1.2 動物實驗驗證

1.2.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠30只，體質量22~23 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養于首都醫科大學附屬北京中醫醫院動物房，室溫（24±2）℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替環境，攝食飲水自由。本研究的動物實驗獲得了首都醫科大學附屬北京中醫醫院實驗動物倫理委員會的批準，動物倫理批號：BJTCM-M-2021-05-02。

1.2.2 藥物與試劑 熟地鎖陽方，方藥組成：熟地黃30 g，鎖陽20 g，山萸肉20 g，牛膝30 g，人參20 g，麥冬20 g，當歸10 g，五味子10 g。熟地黃（批號：21040101）、鎖陽（批號：20210204）、山萸肉（批號：21011101）、牛膝（批號：21031401）、人參（批號：20210912）、麥冬（批號：200409）、當歸（批號：21082601）、五味子（批號：21051504）均購自首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房，并經首都醫科大學附屬北京中醫醫院王玉光教授鑒定為正品；上述中藥飲片在煎煮之前用去離子水浸泡60 min，煎煮2次，將2次煎煮的藥液合并，每劑中藥濃縮至生藥濃度約為2.4 g/mL。注射用鹽酸博來霉素（批號：H20055883，規格：1.5萬單位/支）購自浙江翰輝制藥有限公司；4%多聚甲醛（批號：BL539A）購自北京蘭杰柯科技有限公司；無水乙醇（批號：100092683）、二甲苯（批號：10023418）、中性樹膠（批號：10004160）均購自國藥集團化學試劑有限公司；PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒（批號：12183018A）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；一步法熒光定量RT-PCR試劑盒（096A）（批號：PK0445）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；小鼠GAPDH內參引物（批號：B661304-0001）及VEGFA、EGFR引物合成均來自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源Anti-α-SMA一抗（批號：19245T）購自美國Cell Signaling Technology；Anti-GAPDH一抗（批號：60004-1-1g）購自武漢Proteintech公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號：A0208g）購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2.3 主要儀器 JJ-12J型脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；JB-P5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；正置光學顯微鏡（日本尼康儀器有限公司）；Tissuelyser-24型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司）；LightCycler 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀（德國羅氏公司）；BIO-RAD Gel DocTM XR+型化學發光儀（美國Bio-Rad實驗室有限公司）；Centrifuge 5424 R小型離心機（德國艾本德股份公司）；EMMS eSpira Forced Maneuvers型小鼠肺功能儀（英國EMMS公司）。

1.2.4 分組與造模 30只小鼠適應性喂養1周后，逐個稱量體質量，按照隨機數字表法分為對照組、模型組、熟地鎖陽方組，每組10只。目前指南中公認的治療IPF的藥物為吡非尼酮、尼達尼布，既往研究中并未找到確切的證據證明上述兩種藥物對本研究所驗證的靶點（VEGFA、EGFR）具有調控作用，故本研究并未設置陽性藥物組。使用單次氣管內滴注博來霉素的方法造模[12]，模型組和熟地鎖陽方組小鼠單次氣管內滴注博來霉素（5 IU/kg）至氣管，對照組小鼠滴注等體積的生理鹽水至氣管。肺纖維化小鼠模型制備成功評判標準[12]：HE染色結果顯示小鼠正常肺組織結構被破壞，炎癥細胞滲出，肺泡間質增寬；Masson染色結果顯示可見大量藍色膠原纖維沉積。

1.2.5 實驗給藥 參考相關文獻[13]，于模型制備成功后第8天開始給予熟地鎖陽方干預。根據2001年版《藥理實驗方法學》[14]計算臨床等效劑量為熟地鎖陽方組小鼠的給藥劑量，即熟地鎖陽方組小鼠灌胃給予熟地鎖陽方藥液，0.24 g/10 g；對照組及模型組小鼠給予等體積的去離子水灌胃，1次/d，連續給藥21 d。

1.2.6 觀察指標

1.2.6.1 小鼠肺功能 給藥結束后，小鼠行氣管插管術，應用EMMS eSpira Forced Maneuvers有創肺功能儀，檢測小鼠的用力肺活量（FVC）、吸氣能力（IC）。

1.2.6.2 小鼠肺系數 收集小鼠的肺組織，用紗布擦拭干凈，稱重，計算肺系數。肺系數（Lung index）=肺濕質量/體質量（mg/g）。

1.2.6.3 組織病理學檢測 將分離的新鮮左肺組織在4%多聚甲醛中固定48 h，常規石蠟包埋、切片（5 μm）、脫蠟，分別運用HE和Masson的三色試劑盒染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織的炎癥與纖維化情況。

1.2.6.4 實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）檢測VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量 稱取小鼠右肺組織適量，加入1×磷酸鹽平衡生理鹽水PBS勻漿。然后根據PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒說明書提取總RNA。依據一步法熒光定量RT-PCR試劑盒（096A）中的說明書，配置相應的體系。在96孔板每孔中加入總RNA 2 μL，同時加入18 μL的反應體系，將96孔板放入熒光定量PCR儀中進行定量檢測。PCR儀設置的條件為：45 ℃5 min，95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40個循環。以小鼠GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量。引物序列：VEGFA，上游引物TAGAGTACATCTTCAAGCCGTC，下游引物CTTTCTTTGGTCTGCATTCACA；EGFR，上游引物ACAGAAGGAGTAGATACGCTTG，下游引物GATTATTCGATGATGCTTCCCG。

1.2.6.5 Western blotting法檢測α-SMA蛋白相對表達量 將混合蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液加入肺組織勻漿中，裂解以獲得總蛋白；應用SDS-PAGE分離等量的蛋白質，轉移到PVDF膜上；使用由TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，在4 ℃條件下與兔源Anti-α-SMA（1∶1 000）、Anti-GAPDH（1∶5 000）一抗孵育過夜。與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（1:1 000）二抗室溫搖床孵育2 h后，將化學發光顯色劑滴加于PVDF膜上，運用化學發光儀對免疫印跡進行可視化。GAPDH被用作負荷對照。所有值均根據GAPDH蛋白水平的條帶強度進行標準化，同時應用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析。

1.2.7 統計學方法 所有數據采用GraphPad Prism 8.0軟件和SPSS 26.0軟件進行統計分析及作圖。計量資料以“均數±標準差”表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熟地鎖陽方中有效化合物篩選 通過TCMSP與BATMANTCM數據庫收集熟地鎖陽方的有效化合物，共獲得115個有效化合物，然后根據Degree進行評分后，由高到低進行排序，選取Degree≥110的化合物作為小分子配體，共5個。（見表1）

表1 熟地鎖陽方有效成分信息表（Degree≥110）

2.2 “藥物-疾病”潛在作用靶點 共獲得藥物、疾病的潛在作用靶點分別為847、837個，得到163個“藥物-疾病”潛在作用靶點。將“藥物-疾病”潛在作用靶點運用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA進行拓撲分析后，篩選得到的核心靶點為VEGFA、EGFR、MAPK1、TP53、AKTI、MAPK14、TNF、FOS、JUN。（見圖1）

圖1 核心作用靶點篩選

2.3 分子對接結果 為預測熟地鎖陽方治療IPF可能的潛在作用靶點，選取熟地鎖陽方中Degree≥110的化合物作為小分子配體，包括十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十八烯酸（9-octadecenoic acid）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山奈酚（kaempferol）。結合相關文獻[15-17]，本研究選取VEGFA、EGFR為大分子受體，應用AutoDock_Vina進行分子對接，根據結合能結果，預測大分子受體與小分子配體的結合活性及對接是否良好。依據相關文獻顯示[18]：若結合能≤-7.0 kcal/mol則表示具有明顯結合活性，若結合能＜-5.0 kcal/mol則表示結合活性較好，若結合能＜-4.0 kcal/mol則表示有一定的結合活性。本研究結果顯示，VEGFA、EGFR與上述5種化合物均存在結合活性，≤5.0 kcal/mol者占總數70%，≤-7.0 kcal/mol者占總數60%，則表示絕大部分靶點和成分的結合活性較強。（見表2、圖2）

圖2 分子對接模擬圖（部分）

表2 熟地鎖陽方有效化合物與核心靶點分子對接結果

2.4 各組小鼠FVC、IC、肺系數及肺組織中α-SMA蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組小鼠FVC、IC均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠FVC、IC均明顯升高（P＜0.01），提示熟地鎖陽方可明顯改善肺纖維化小鼠的肺功能。與對照組比較，模型組小鼠肺系數及肺組織中α-SMA蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺系數及肺組織中α-SMA蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 各組小鼠FVC、IC、肺系數及肺組織中α-SMA 蛋白相對表達量比較

2.5 各組小鼠肺組織病理學改變情況 HE染色結果顯示：對照組小鼠肺組織結構清晰、完整，未見炎癥細胞浸潤及結締組織增生；模型組小鼠肺組織結構被破壞，肺泡融合塌陷、結構紊亂，肺泡腔內有不同程度炎癥細胞浸潤，肺泡間質增寬，同時也有不同程度炎癥細胞滲出；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺組織上述病理變化均有不同程度的好轉，肺泡融合塌陷較少，肺組織結構較完整，病變范圍局限，炎性滲出物減少。（見圖4）

圖4 各組小鼠肺組織病理切片圖 （×200）

Masson染色結果顯示：對照組小鼠肺組織結構清晰、完整，未見明顯的藍色膠原纖維沉積；模型組小鼠肺組織結構被破壞，肺泡融合塌陷、結構紊亂，可見大量藍色膠原纖維沉積；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺組織藍色膠原纖維的沉積減少。（見圖4）

2.6 各組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.01）。（見圖5）

圖5 各組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量比較 （±s，n=6）

3 討 論

IPF是一種慢性、進展性間質性肺疾病，其特征是纖維化組織在肺實質中進行性異常積聚[19]。雖然抗纖維化藥物（吡非尼酮、尼達尼布）應用于臨床使IPF的治療取得了突破性進展，但因其費用較昂貴、部分患者不耐受等，需積極探索與開發新的治療藥物。本病因氣虛而起，雖與肺、脾、腎等臟均相關，但其重點仍在于腎精虧虛，故其病機與肺腎虧虛、攝納失司有關，治予熟地鎖陽方。熟地鎖陽方是由《景岳全書》中的貞元飲及《辨證錄》中的定喘神奇丹加減而成。方中熟地黃、山萸肉滋腎陰，益精髓；鎖陽以陽中求陰，以達補陰及益精血之目的；人參益肺腎之元氣，與熟地黃合用，以陰中求陽，生精生血；麥冬甘寒養陰，入肺經，以養肺陰；牛膝既引血下行，又補其下元之氣，以補益腎精；當歸補血活血，使補而不滯，并防熟地黃之膩；五味子味酸收斂，甘溫而潤，能上斂肺氣，下滋腎陰；全方溫斂并用，補中有降，共奏補腎益肺、填精納氣、調補陰陽之功。

本研究預測結果顯示，熟地鎖陽方主要化合成分包括十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十八烯酸（9-octadecenoic acid）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山奈酚（kaempferol）等。據相關研究報道[20]，單羥基十四烷酸異構體具有抗脲酶、抗磷酸酶和抗氧化活性，而IPF的發病機制包括氧化應激反應及TGF-β、PI3K/Akt等信號通路中相關靶點發生磷酸化使信號通路激活，促使上皮間質轉化、細胞外基質沉積及成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化等，故十四烷酸可能是治療IPF的一個潛在化合物[21]。BHAGAT M等[22]研究顯示，雪松樹皮揮發油中主要成分9-十八烯酸等化合物與NF-κB具有顯著的結合親和力，可使結腸癌細胞中NF-κB的表達水平降低。而NF-κB在IPF發病機制中發揮重要作用，NF-κB激活后可介導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化。由此可知，9-十八烯酸可能會通過調控NF-κB表達而改善肺纖維化程度[23]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抑制炎癥反應、改善氧化與抗氧化系統功能、調控TGF-β1表達、調節成纖維化細胞凋亡與增殖等作用，是治療IPF的一個重要化合物[24]。張興彩等[25]研究發現，槲皮素可顯著降低FN、α-SMA、Collagen I等肺纖維化相關蛋白的表達水平，通過調控S1P/SphK1信號通路而發揮其改善小鼠肺組織纖維化程度的作用。豆甾醇具有較強的表面活性與生理活性，其主要作用包括抗炎、抗氧化及抗腫瘤等[26]。山奈酚屬于黃酮類化合物中的一種，具有抗氧化、抗炎及免疫調節等作用[27]。GONG J H等[28]研究顯示，山奈酚可逆轉E-鈣黏蛋白的表達，降低N-鈣黏蛋白及α-SMA表達水平，顯著抑制TGF-β誘導的上皮間質轉化過程，減少小鼠肺組織膠原沉積，減輕纖維化氣道重塑。因此，篩選出的有效化合物很有可能是熟地鎖陽方治療IPF的關鍵化合物。

本研究共篩選得到VEGFA、EGFR、MAPK1、TP53等9個核心作用靶點。IPF的纖維化機制仍不明確，與異常修復、膠原纖維大量沉積和血管重塑發展相關[29]。多種信號通路參與IPF的發生發展，如TGFβ、PI3K/AKT及VEGF信號通路等[30-31]。VAGFA為血管內皮生長因子A，可影響肺泡Ⅱ型細胞生長、表面活性劑的產生及血管的生成，在肺損傷后修復過程中發揮重要作用[32]。相關報道[33]顯示，IPF患者外周血中VEGFA表達水平與疾病的嚴重程度及進展相關。相關的基礎研究[34]也證明，在BLM誘導的肺纖維化大鼠肺組織中VEGFA的表達水平顯著升高。BARRATT S L等[35]研究顯示，VEGFA可調節HIF-1α的表達，是肺纖維化的驅動因素。EGFR即表皮生長因子受體其參與肺纖維化的發生發展，可能是通過上皮細胞和成纖維細胞之間的EGFR通路依賴性旁分泌環發生的。EGFR可導致過度的膠原生成和沉積[36]。ISHII Y等[37]研究顯示，抑制EGFR可緩解BLM誘導的小鼠肺纖維化程度。由此可知，VEGFA、EGFR在IPF的發生發展中發揮重要作用，可能是治療IPF的靶點。

本研究結果顯示，VEGFA、EGFR與所篩選的關鍵的5種化合物均存在結合活性，且絕大部分靶點和成分的結合活性較強。動物實驗結果顯示，熟地鎖陽方可改善肺纖維化小鼠的肺功能，降低肺組織的炎癥細胞浸潤、改善肺結構及減少膠原纖維的沉積，降低肺系數，并可明顯降低肺組織中α-SMA蛋白相對表達量及VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對表達量。本研究表明熟地鎖陽方對IPF具有治療作用，VEGFA、EGFR可能是熟地鎖陽方干預IPF的重要作用機制與關鍵靶點。本研究為臨床應用熟地鎖陽方治療IPF提供了理論基礎，同時也為后續的基礎實驗提供了一定方向，但其具體的作用機制仍需進一步的實驗深入驗證。