小麥超氧化物歧化酶基因家族鑒定及鹽脅迫下響應鋅鉀的表達分析

楊林林韓敏琦高嘉楊勝敏

(1. 北京農業職業學院，北京 102442；2. 北京清河水利建設集團有限公司，北京 100192)

活性氧(ROS)是細胞代謝產生的羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·-)和過氧化氫(H2O2)等一系列副產物[1]。 ROS 是生物體所必需的信號分子，影響著細胞分化、凋亡及胞間物質傳導。 正常條件下，細胞內ROS 的產生和清除處于動態平衡狀態；然而，植物生長過程中經常會受到極端溫度、水分、鹽分、重金屬離子等各種脅迫，這往往會導致ROS 過量累積[2]。 ROS 的過量積累會誘導氧化應激，破壞膜脂、蛋白質、核糖核酸和光合色素，嚴重時甚至導致細胞死亡[3]。 為了消除ROS 毒性并保護細胞免受氧化應激帶來的損傷，植物已經進化出有效的機制來減輕損害[4]，如一些抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等，可有效清除植物體內過量的ROS，以維持植物體內正常的生理代謝[5]。

SOD 是抗氧化防御系統的首位限速酶，可以通過催化O2·-歧化為H2O2和O2以減少ROS 造成的損害[6]。 生物體含有一系列SOD 同工酶，均屬于金屬蛋白酶。 根據催化位點金屬輔因子的不同，SOD 可分為四種類型，即Cu/Zn-SOD(CSD)、Mn-SOD(MSD)、Fe -SOD(FSD) 和Ni -SOD(NSD)[7]。 FSD 和MSD 主要存在于低等植物中，CSD 主要存在于高等植物中，NSD 存在于鏈霉菌、藍細菌和海洋生物中[8]。 這些SOD 分布在細胞的不同區域，在應對氧化應激中起關鍵作用。前人研究發現，FSD 存在于線粒體和葉綠體中，MSD 主要存在于線粒體和過氧化物酶體，CSD 主要存在于葉綠體和細胞質，而NSD 主要存在于細胞質中[9]。 目前，已對許多植物的SOD基因家族成員進行了分子解析，包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)、丹參(Salvia miltiorrhiza)、玉米(ZeamaysL.)、煙草(Nicotiana tabacumL.)、水稻(Oryza sativaL.)等，結果表明，不同物種的SOD基因家族組成不同，同一物種的不同基因型間SOD組成亦存在一定差異；此外，同一類型的SOD基因在不同物種中作用也不盡一致[7，10]。

小麥(Triticum aestivumL.)是世界上廣泛種植的谷類作物之一，含有高比例的碳水化合物、蛋白質、礦質營養及膳食纖維，是全球85%以上人類和牲畜的主要食物原材料[11]。 然而，小麥產區往往處于干旱或半干旱環境，長期灌溉和施肥使得土壤鹽漬化加劇，但現推廣的大多數小麥品種對土壤鹽的耐受性較低、敏感性較強[12]，這在一定程度上致使小麥產量和品質顯著下降。 小麥SOD基因分析可為其抗性遺傳改良提供重要信息，然而到目前為止，在全基因組水平上檢測小麥SOD(TaSDs) 基因家族組成的研究較少。 本研究以‘西農979’為試材，對小麥SOD基因家族進行全基因組鑒定，并綜合分析TaSDs的系統發育關系、基因組內的分布、基序組成、不同組織中的表達譜以及鹽脅迫下TaSDs響應鋅鉀的功能作用，以期為進一步研究小麥抗逆性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2021年12月在北京農業職業學院技術示范區龐各莊實驗站進行。 供試小麥品種為‘西農979’，種子來自中國農業科學院。 供試氯化鈉(NaCl)、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、氯化鉀(KCl)均購自北京索萊寶化學生物試劑有限公司。

1.2 小麥SOD 基因家族成員的鑒定和系統發育分析

1.2.1 小麥SOD 基因的鑒定小麥的核苷酸、蛋白質序列和基因注釋(General Feature Format Version 3， GFF)信息從IWGSC 公共數據庫(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies)獲取，并從Pfam 數據庫(pfam.sanger.ac.uk/)下載小麥SOD 的DAN-binding 結構域信息(PF00199)，將其結構域信息保存為隱藏馬爾可夫格式(HMM)。 使用HMMER 3.0 搜索工具對HMM 進行初步檢索與篩選[13]。 使用NCBI 保守域數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)對HMM 進行進一步篩選，借助Pfam數據庫(http:/ /pfam.xfam.org/)再次篩選以去除冗余、缺失或不正確的序列，得到最終的SOD 蛋白質家族。 按照小麥基因命名指南(http:/ /wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/98/Intro.htm/)所述的分類方法對小麥SOD 蛋白質家族進行命名與分類，以得到TaSDs基因家族信息。

1.2.2 TaSDs 理化性質表征分析采用ExPASy(https://web. expasy. org/protparam/) 和 WoLF PSORT 在線工具(https://www.genscript.com/wolfpsort.html)預測TaSDs的理化特性和亞細胞定位；根據各TaSDs在基因組注釋中的位置，使用Map-Inspect 軟件檢測TaSDs的染色體分布；根據Savadi 等[14]所述方法對TaSDs進行基因重復分析。

1.2.3 TaSDs 系統發育分析為了進一步闡明TaSDs與其他物種SOD基因家族(SDs)之間的進化關系，下載并比較分析了擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea maysL.)、谷子(Setaria italica)和水稻(Oryza sativaL.)的SOD 蛋白序列。 使用MUSCLE 進行全長蛋白質比對[15]，并借助MEGA-X 在線軟件(https://www. megasoftware.net/)采用鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap 設置為1 000，其余參數為默認值。

1.2.4 TaSDs 染色體定位及共線性分析從IWGSC 公共數據庫下載得到小麥的GFF3 基因組注釋文件，借助MapInspect 軟件將TaSDs一一定位到染色體上，并獲得每條染色體的基因密度譜。借助TBtools 軟件將物種內和不同物種之間的染色體定位和基因重復進行可視化分析。

1.2.5 TaSDs 的保守結構域、基序和啟動子序列分析TaSDs 蛋白的保守域采用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 保守域搜索工具(CD Search)進行檢測，使用GSDS 2.0 在線工具(http:/ /gsds.gao-lab.org/)檢測TaSDs家族成員的內含子-外顯子結構，使用MEME 在線軟件(https://meme-suite.org/meme/)鑒定TaSDs的保守蛋白基序，使用TBtools 軟件可視化TaSDs的保守結構域。 為了進一步鑒定TaSDs啟動子區域的推定順式調節元件，借助TBtools 軟件獲得TaSDs基因的起始密碼子上游2 000 kb 序列(2-kb 5')，采用PlantCARE 數據庫(http:/ /bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進一步分析預測TaSDs的順式調控元件。

1.3 TaSDs 基因家族響應不同鹽脅迫類型的表達分析

1.3.1 供試小麥培養方法小麥種子采用0.5%NaClO 進行表面滅菌10 min，用去離子水沖洗數次并浸泡6 h，然后放置于鋪墊潤濕濾紙的培養皿中，28 ℃培養箱暗處理催芽48 h。 催芽結束后，先用1/4Hoagland 營養液培育4 d， 然后用1/2Hoagland 營養液[16]培育3 d，之后用150 mmol/L NaCl 處理小麥幼苗，1 h 后進行相應Zn、K 處理，其中，Zn、K 目標離子均為200 mmol/L，對照(CK)則加入無菌水。 培養期間，光周期為10 h/14 h(晝/夜)，溫度為26 ℃。 每處理設置3個生物學重復。 將小麥植株根系、地上部分開后立即用液氮冷凍，并儲存于-80 ℃用于RNA 提取。

1.3.2 小麥RNA 的提取 將小麥樣品(250 mg)在液氮中快速研磨，按照Plant RNAiso Plus 提取試劑盒(Omega)相關說明提取小麥總RNA，采用Nano Drop 2000 紫外分光光度計(Nano Drop 2000，USA)檢測RNA 濃度，采用2%葡萄糖檢驗RNA 質量。

1.3.3 小麥RT-qPCR 分析將質檢合格的RNA用帶有gDNA Eraser (TaKaRa RR047Q，北京寶日醫生物技術有限公司)的PrimeScript RT 試劑盒逆轉錄為cDNA。 將cDNA 用無菌水稀釋100 倍，作為后續RT-qPCR 的模板。 相關引物(表1)采用Premier 5.0 軟件設計，以Actin(Gene ID:AB181991)作為內參基因。 RT-qPCR 反應體系與反應程序參照劉佳月等[17]所述，使用Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories Inc.， USA)的C1000 Touch PCR 熱循環儀和CFX Connect 實時檢測系統進行RT-qPCR 分析，每個處理進行3個復孔。 用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。 使用Origin 2020 軟件繪圖。

表1 小麥基因的qRT-PCR 引物序列信息

2 結果與分析

2.1 小麥SOD 基因家族理化性質特征分析

經Blast 序列比對、除冗余和蛋白結構域篩選后，共挖掘出10個SOD家族成員，按照基因在染色體上的初步預測位置及命名指南，將其分別命名為TaCSD1～TaCSD4、TaFSD1 ～TaFSD4、TaMSD1 ～TaMSD2。 由表2 可知，小麥SOD基因家族蛋白質長度152 ～382 aa，分子量在15.17 ～42.87 kDa之間；等電點為5.33 ～8.84，其中僅TaFSD2、TaFSD3 為堿性蛋白(等電點大于7)，其余均為酸性蛋白。 亞細胞定位預測顯示，TaCSD1、TaCSD2 蛋白位于細胞質中，TaCSD3、TaCSD4、TaFSD4 則位于葉綠體中，其余5個TaSDs 均位于線粒體中。

表2 小麥SOD 基因家族理化性質

2.2 TaSDs 基因系統發育關系和分類

為了進一步研究雙子葉植物和單子葉植物中SOD 蛋白的系統發育關系，基于37個全長蛋白質序列的比對構建系統發育樹，其中包括小麥的10個序列、玉米的3個序列(ZmFSD1、ZmCSD1、ZmCSD2)、谷子的8個序列(SiCSD1、SiCSD2、SiCSD3、SiCSD4、SiFSD1、SiFSD2、SiFSD3 和SiMSD)、水稻的8個序列(cCuZn-SOD1、cCuZn-SOD2、CuZn-SOD-L、pCuZn-SOD、CuZn-SOD-CCh、Fe-SOD3、Fe-SOD2 和Mn-SOD1)、擬南芥的8個序列(AtCSD1、AtCSD2、AtCSD3、 AtFSD1、 AtFSD2、 AtFSD3、 AtMSD1 和AtMSD2)。 根據系統發育樹，這37個SOD 蛋白可分為兩組，Ⅰ組為Fe/MnSODs，Ⅱ組為Cu/ZnSODs，與它們所包含的結構域類型一致(圖2)。Ⅰ組包含19 種SOD 蛋白，可進一步分為3個亞組；在Ⅱ組中，18 種SOD 蛋白分為4個亞組。 聚集在同一亞組中的大多數SOD 蛋白具有較為相同的亞細胞定位(表2)，例如，在線粒體的FSDs(TaFSD1、TaFSD2、TaFSD3)、MSDs(TaMSD1、TaMSD2)分別聚為a、c 亞群。 此外，在每個亞組中，我們發現TaSDs 與玉米、谷子及水稻的關系比擬南芥更密切。

圖1 5個物種SOD 家族系統發育分析

圖2 TaSDs 基因家族編碼蛋白的基因結構與保守基序分析

2.3 TaSDs 基因結構及保守結構域分析

2.3.1 TaSDs 基因結構與保守基序分析使用GSDS 2.0 在線工具分析了35個SOD基因組(圖2A)的結構信息，即所有序列中的外顯子-內含子數量和分布。 由圖2B 可知，外顯子和內含子的數量在單子葉和雙子葉植物的基因之間存在較大差異，外顯子的數量為1 ～9 不等。 水稻、高粱、玉米和小麥的SOD基因有1～8個外顯子，擬南芥和油菜的SOD基因有7～9個外顯子，而所有TaSDs都具有1～7個內含子和2～7個外顯子。

為了更好地了解SOD基因家族，使用NCBI保守域數據庫對SOD 蛋白的保守域進行分析，并構建所有SOD 蛋白結構的示意圖(圖2C)，可見，所有SOD 蛋白均包含一個超氧化物歧化酶核心結構域(PF00199，Superoxide dismutase)和一個超氧化物歧化酶免疫反應結構域(PF06628，Superoxide dismutase-rel)，且來自不同物種的SOD基因具有高度的序列和基因結構相似性，揭示了SOD基因家族成員之間的進化仍具有保守性。

2.3.2 TaSDs 基因保守蛋白質基序分析由圖3可知，CSD 的所有保守結構域的bits 值皆大于1，表明TaSDs 蛋白中的8個氨基酸(甘氨酸、亮氨酸、組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和脯氨酸)基序均為保守結構蛋白質基序。 類似的，FSD 包括8個保守氨基酸(纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和組氨酸)，而MSD 則包括FSD 和鐵基的保守金屬結合結構域DVWEHAYY。 以上結果表明，小麥SOD基因家族中的不同亞家族(CSD、FSD、MCD)含有其特有的氨基酸序列組成，且均包括一系列高度保守的活性位點殘基，這些殘基可能在催化離子(如Fe2+、Zn2+)的序列特異性結合中發揮作用。

圖3 TaSDs 基因保守蛋白質基序分析

2.4 TaSDs 基因的染色體定位

為了確定TaSDs基因在染色體上的位置及相關基因擴增片段區域，基于小麥基因組數據庫IWGSC 的最新數據，以97%的序列映射到染色體以及無法映射到任何染色體的為錨定支架，結果(圖4)顯示10個TaSDs基因中，除TaFSD4外，其余9個SOD基因均可被定位到小麥染色體上，且該9個基因不均勻地分布在8個不同染色體臂的遠端區域；其中，TaCSD3和TaMSD1聚集成串聯重復事件區域，但這些串聯基因在任何其他亞基因組中都沒有同源拷貝。 此外，TaSDs基因家族擴增和重復之間的關系顯示，TaFSD2、TaFSD3、TaFSD1為同源基因；TaCSD2、TaCSD1、TaCSD4為同源基因，且與TaFSD2、TaFSD3、TaFSD1構成不同的同源基因組。 這些結果表明TaSDs家族的進化是由片段復制和基因串聯事件驅動的。

圖4 TaSDs 基因的染色體定位

2.5 TaSDs 基因啟動子中的順式元件分析

結果(圖5)表明，除一些光照、細胞分化調控等基本核心元件外，TaSDs 還含有激素反應元件(ABA、GA、SA、Me-JA)以及缺氧或厭氧誘導元件等，這些順式作用元件是非生物應激反應的關鍵組成部分。 例如，TaCSD1、TaCSD4含有與冷脅迫相關的順式元件，而TaFSD3、TaFSD4、TaCSD4、TaMSD2含有水楊酸(SA)反應元件；TaFSD2、TaCSD2、TaCSD3的啟動子特異地含有一個與分生組織表達相關的元件，表明其可能與分生組織的發育有關。 此外，在大多數啟動子區域內發現了一些轉錄因子結合位點，如MYB 結合位點，表明TaSDs基因可能受MYB 轉錄因子的調節。 總的來說，同一類別的TaSDs基因可能具有不同的作用方式，并且不同類別的基因也可能具有協同作用。

圖5 TaSDs 基因啟動子的順式元件分析

2.6 TaSDs 基因在鹽脅迫下的表達模式分析

由圖6 可知，鹽脅迫(NaCl)和無鹽脅迫對照(CK)條件下，TaFSD4、TaMSD2、TaFSD3在小麥地上部(shoot)和根系(root)中均具有較高的表達水平，而TaFSD1均不表達。TaCSD2僅在鹽脅迫0、12、24 h 的小麥根系中高表達。TaMSD1、TaCSD4、TaCSD1均在小麥根系中表達。 特別的，TaCSD3、TaFSD2在鹽脅迫12、24 h 的根系、地上部中高表達，而在鹽脅迫0 h 及對照的根系、地上部不表達或極低表達，初步表明這兩個基因可能參與了鹽脅迫的調控，應在后續研究中予以重視。

圖6 TaSDs 基因在鹽脅迫和對照小麥不同部位的Heatmap 分析

2.7 TaCSD3 基因在鹽脅迫下及響應鋅鉀的表達分析

根據TaSDs表達譜分析結果，選擇可能參與鹽脅迫調控的TaCSD3，進一步研究其在鹽脅迫下的表達水平及響應Zn、K 的表達情況。 由圖7 可知，無論在無鹽脅迫處理(CK)還是無鹽脅迫處理下的相關鋅鉀處理(Zn、K、Zn+K)中，TaCSD3在小麥根系和地上部中均幾乎不表達；而在150 mmol/L NaCl 處理下，TaCSD3表達水平較CK 顯著升高，增施Zn、K 后其表達水平進一步顯著提高，在同時增施Zn 和K 處理下最高，即無論是在根系還是地上部中各處理表現為NaCl＜NaCl+K＜NaCl+Zn＜NaCl+Zn+K，且TaCSD3在根系的表達水平明顯高于地上部。TaCSD3在不同組織中的表達模式與轉錄組測序結果基本一致，進一步證實了上述TaSDs基因表達數據的可靠性，同時表明TaCSD3是響應鹽脅迫的指示性SOD基因，同時受Zn、K 正向調控。

圖7 TaCSD3 基因在鹽脅迫下響應鋅鉀的表達分析

3 討論與結論

小麥是世界第二大糧食作物，對保障人類糧食安全具有重要意義[11]。 然而，小麥生長發育及產量易受到土壤鹽漬帶來的不利影響。 在植物防御系統中， SOD 在清除細胞內過量的活性氧自由基中發揮著重要作用[6-8，18]。 已在多種植物物種中進行了SOD家族基因的研究，鑒定小麥SOD基因并確定其在鹽脅迫響應中的功能可為小麥抗鹽育種提供優良的基因靶點。 本研究基于pfam搜索和蛋白質Blast 對比，在小麥品種‘西農979’中鑒定出10個SOD基因(TaSDs)，包括4個Cu/Zn-SODs 基因(TaCSDs)、4個Fe-SODs 基因(TaFSDs)和2個Mn-SODs 基因(TaMSDs)；這些蛋白質長度在152 ～382 aa，分子量在15.17 ～42.87 kDa，且多為酸性蛋白，主要分布于線粒體、葉綠體、細胞質中。SOD基因的數量因植物而異，水稻、高粱和番茄中往往更少，這種差異可能歸因于基因重復(串聯和節段重復)[7，19]。

系統發育分析表明，5個物種的37個SOD 蛋白可以分為Fe/Mn-SODs 和Cu/Zn-SODs 兩組，其中，前者包含19個SOD 蛋白，可進一步分為3個亞組；后者包含18個SOD 蛋白，可分為4個亞組。 此外，來自單子葉植物(小麥、玉米、谷子和水稻)和雙子葉植物(擬南芥)的SOD 更傾向于分散分布，且單子葉植物的SOD 更易聚集在Fe/Mn-SODs 組中，表明這些基因可能共享共同的祖先基因。 然而，一些小麥SOD 與其旁系同源蛋白以外的其他物種的直系同源物表現出密切的系統發育關系，表明其與這些直系同源物可能起源于共同的祖先，并在早期基因組變異后分化。

基因結構已被確定為基因家族進化的代表性標志之一[20]。 本研究結果表明，TaSDs的外顯子和內含子在單子葉植物和雙子葉植物之間亦存在差異，所有TaSDs都具有1～7個內含子和2～7個外顯子。 前人研究也表明，一個SOD基因的祖先拷貝有7個內含子[21]。 可見，TaSDs基因在進化過程中經歷了外顯子和內含子的變化，相應的TaSDs含有超氧化物歧化酶結構域。 此外，TaSDs的不同亞家族(CSD、FSD、MCD)有各自特有的氨基酸序列組成，包含一系列高度保守的活性位點殘基。 以上結果表明這些基因在進化過程中是保守的。

基因串聯重復事件經常發生在植物進化過程中，與片段重復事件共同被認為是增加基因家族多樣性的關鍵機制，而基因重復在SOD基因的多樣化擴展中亦起著至關重要的作用[22]。 本研究中，除TaFSD4外，其余9個SOD基因均被定位到8個不同的染色體上；發現了串聯重復的SOD基因對，即TaCSD3與TaMSD1，該兩基因在任何其他亞基因組中均沒有同源拷貝。 一般而言，單子葉植物基因應在亞基因組中同時具有3個同源拷貝[7]；然而TaCSD3、TaMSD1僅為兩個，這可能是小麥α-型亞基在染色體之間發生易位以及進化過程中基因組多倍化和基因復制的結果[23]。

基因表達受許多參與各種途徑的順式作用元件和反式作用因子的相互作用調節[8]。 前人研究已經證實，一些SOD基因可被不同的元件途徑所誘導，例如寒冷、高溫、激素[21，24-25]等。 本研究結果表明，TaSDs基因啟動子包含各種應激反應元件，如冷反應、厭氧誘導元件；一些TaSDs啟動子還包括MYB 結合位點，表明這些SOD基因可能受MYB 轉錄因子的調節；此外，一些TaSDs基因啟動子中還發現了一些響應分生組織表達、細胞周期調控以及光、激素(ABA、SA、GA、Me-JA、IAA) 反應的元件，表明TaSDs基因可能通過調節活性氧代謝網絡參與植物生長和細胞分化。

礦質養分在提高植物的鹽脅迫耐受性方面起著重要作用。 鉀(K)是一種常量營養元素，在調節植物生理生化中起著重要作用，K+與Na+往往共用同類運輸蛋白，因此增加對K+的攝取可以降低對Na+的吸收，從而避免鹽誘導的氧化應激和相關細胞損傷[26]。 鋅(Zn)是重要的微量營養物質，是Cu/Zn-SODs 亞家族編碼蛋白特殊位點的重要催化物質之一[27]，能最大限度地減少鹽堿化的有害影響，降低NADPH 氧化酶的活性以減少活性氧的產生，從而減輕膜脂過氧化[28]。 Zn、K在基因調控、蛋白質合成、降低氧化損傷和DNA轉錄中均起著關鍵作用[26，29]。 本研究中，基于RNA 轉錄組的Heatmap 分析顯示，TaCSD3基因可能參與鹽脅迫的調控；進一步的RT-qPCR 分析顯示，TaCSD3在無鹽脅迫下不表達，而在鹽脅迫下顯著上調表達，且受Zn、K 的誘導進一步上調表達，在NaCl+Zn+K 處理下表達水平最高。 表明TaCSD3是影響鹽脅迫的靶向SOD基因，同時受Zn、K 正向調控。 本研究結果為未來研究小麥SOD 蛋白在生物過程中的功能奠定了基礎，也為小麥在鹽脅迫育種方面的改良提供了理論依據。