基于高效液相色譜指紋圖譜及化學計量學的半枝蓮質量分析

竇錦明,常躍興,荊漢衛,張天欣,王振華*

1. 濰坊市中醫院藥學部,濰坊 261041; 2. 安徽理工大學醫學院,淮南 232063;3. 濰坊市檢驗檢測中心,濰坊 261061;4. 山東中醫藥大學,濟南 250355

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD. Don的干燥全草,味辛、苦,性寒,歸肺、肝、腎經,具有清熱解毒、化瘀利尿的功效。用于疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌撲傷痛、水腫、黃疸和蛇蟲咬傷的治療。現代藥理研究結果表明,其具有解熱、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫、利尿、抑菌及抗病毒等作用,常用于治療疔瘡、肺癰、急性腎炎和癌癥[1-2]。

目前,大多數學者對半枝蓮所含的化學成分已達成共識,其主要含有黃酮類、二萜類、生物堿、香豆素、多糖和甾醇等成分[3-4],但半枝蓮質量評價的方法不盡相同。有學者以黃酮、總黃酮含量評價半枝蓮質量[5-6],有學者以萜類評價半枝蓮質量[7-8],均無法全面反映半枝蓮所含的化學成分。本文收集不同產地的12批半枝蓮,用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜[9-11]結合化學計量學[12]技術建立半枝蓮的質量控制方法,旨在為半枝蓮的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT(SPD-M20A檢測器)高效液相色譜儀、AUW120D型分析天平均購自島津制作所;KQ-250型超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

木犀草苷(批號111720-202111)、野黃芩苷(批號110842-202010)、芹菜素(批號111901-202004),木犀草素(批號111520-202107)、半枝蓮對照藥材(批號121293-202105),均購自中國食品藥品檢定研究院;12批[S1(對照藥材)、S2(廣西玉林)、S3(廣西南寧)、S4(廣西柳州)、S5(廣東梅州)、S6(廣東清遠)、S7(廣東揭陽)、S8(云南昆明)、S9(云南普洱)、S10(云南大理)、S11(河南駐馬店)、S12(河南平頂山)、S13(河南南陽)]半枝蓮經濰坊市檢驗檢測中心荊漢衛主任中藥師鑒定為唇形科半枝蓮ScutellariabarbataD. Don的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～15 min,15%～18% A;15～30 min,18% A;30～45 min,18%～25% A;45～60 min,28%～38% A;60～65 min,38%～90% A;65～70 min,90% A。梯度流速0～15 min,1.0 mL·min-1;15～30 min,0.8 mL·min-1;30～70 min,1.0 mL·min-1。進樣量為10 μL,檢測波長為335 nm,柱溫為30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1對照品溶液 分別精密稱取木犀草苷、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素對照品適量,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,得對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 精密稱取12批半枝蓮樣品粉末(過3號篩)約1.0 g,置于具塞三角瓶中,加體積分數50%甲醇50 mL,稱定質量,超聲處理40 min,放冷,再稱定質量,用體積分數為50%的甲醇補足減失的質量,搖勻,經0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,得供試品溶液。

2.2.3對照藥材溶液 精密稱取半枝蓮對照藥材粉末(過3號篩)約1.0 g,按照2.2.2項下方法制備。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度實驗 取2.2.3項下制備的對照藥材溶液,按照2.1項下的色譜條件進樣6次,得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.0%,表明儀器的精密度良好。

2.3.2穩定性實驗 取對照藥材溶液,按照2.1項下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進樣,得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.0%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3重復性實驗 取6份對照藥材粉末,按照2.2.2項下的方法制備,按照2.1項下色譜條件進樣,得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.0%,表明該方法的重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

取12個批次半枝蓮供試品溶液,按照2.1項下的色譜條件測定。將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012年版”分析,以S1對照藥材的色譜圖為參照圖譜,生成半枝蓮HPLC指紋圖譜,見圖1。

注:紫外吸收光譜圖:波長190～400 nm;黑線為對照藥材光譜;紅線為對照品光譜。

12批半枝蓮樣品的相似度為0.994～0.972,表明不同產地半枝蓮化學成分的種類相似。標定共有色譜峰30個,與對照品色譜圖(保留時間)、紫外吸收光譜(特征吸收峰)比對,確認4個色譜峰,11號峰為木犀草苷,12號峰為野黃芩苷(參照峰),23號峰為木犀草素,28號峰為芹菜素。半枝蓮HPLC指紋圖譜共有峰的保留時間差別較小,但峰面積差異較大,表明不同產地半枝蓮化學成分的種類相近,但含量有差異。

2.5 化學計量學分析

2.5.1聚類分析(cluster analysis,CA) 將半枝蓮各批次共有峰面積Z-Score標準化,導入MetaboAnalyst 5.0軟件進行K-means聚類分析[13]和Ward聚類分析[14](組間連接,歐式平方距離),見圖2、圖3。由圖2、圖3可知,河南為一類,云南為一類,廣東、廣西為一類,表明各產地半枝蓮的化學成分含量有顯著差異。

圖2 不同產地半枝蓮K-means聚類分析

圖3 不同產地半枝蓮Ward聚類分析熱圖

2.5.2主成分分析(principle component analysis,PCA) 將半枝蓮各批次共有峰面積Z-Score標準化,導入SPSS 26和MetaboAnalyst 5.0軟件進行PCA分析[15],得到3個主成分(特征值>1),其方差貢獻率為PC1(42.70%)、PC2(27.00%)、PC3(12.30%),累積方差貢獻率為82.00%,表明3個主成分代表原始色譜峰的大部分信息。

PCA得分見圖4。由圖4可知,河南為一類,云南為一類,廣東、廣西為一類,與聚類分析結果一致,表明各產地半枝蓮的化學成分含量有顯著差異。將3個主成分矩陣結果(得分>0.800)求并集后,顯示有差異的色譜峰為1、10、12、14、15、16、18、19、11、22號峰。見圖5。

圖4 不同產地半枝蓮主成分分析得分圖

圖5 不同產地半枝蓮主成分分析的成分矩陣得分圖

2.5.3偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA) 將半枝蓮各批次共有峰面積Z-Score標準化,導入MetaboAnalyst 5.0軟件進行PLS-DA分析[16],置換檢驗法(1 000次)顯示P=0.017,LOOCV交叉驗證顯示累積R2=0.971 5,Q2=0.639 65,Accuracy=0.916 67,表明可靠度高。

PLS-DA得分圖見圖6。由圖6可知,河南為一類,云南為一類,廣東、廣西為一類,與聚類分析結果一致,表明各產地半枝蓮的化學成分含量有顯著差異。將3個Components VIP得分結果(VIP 值>1.0)求并集后,結果顯示有差異的色譜峰為1、2、3、6、8、10、11、12、13、14、16、18、19、28號峰。見圖7。

圖6 不同產地半枝蓮偏最小二乘法判別分析得分圖

圖7 不同產地半枝蓮偏最小二乘法判別分析VIP得分圖

2.5.4質量標志物鑒別 對PCA的成分矩陣和PLS-DA的VIP值分析結果取交集,獲得差異化學成分為1、10、11、12、14、16、18、19號峰。半枝蓮的可能藥效部位為黃酮類成分,10、11、12、14、16、18、19號峰均在250～280 nm和310～350 nm范圍內有強吸收,符合黃酮類成分的特征紫外吸收帶。各色譜峰標準化峰面積箱線圖見圖8。結果顯示不同產地化學成分含量有顯著性差異,因此,確定10、11(木犀草苷)、12(野黃芩苷)、14、16、18、19號峰為潛在質量標志物[17]。河南、廣西、云南產地各質量標志物含量波動小于廣東產地,表明河南、廣西、云南產地半枝蓮質量穩定性高于廣東。河南產地各質量標志物含量高于廣東、廣西、云南,表明河南產地半枝蓮質量優于廣東、廣西、云南。

注:縱坐標為峰面積標準化值;橫坐標為產地信息。A.10號峰(保留時間19.635 min);B.11號峰(保留時間20.889 min);C.12號峰(保留時間22.067 min);D.14號峰(保留時間25.265 min);E.16號峰(保留時間30.901 min);F.18號峰(保留時間39.937 min);G.19號峰(保留時間40.769 min)。

3 討論

考察提取溶劑(水,體積分數25%、50%、75%、100%甲醇)和提取時間(20、40、60 min)發現,體積分數50%甲醇超聲40 min提取的色譜峰信息量豐富。考察色譜系統(甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液)顯示,乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液分離效果最佳。用PDA檢測器對各色譜峰在190～400 nm波長范圍內掃描,顯示335 nm處色譜峰基線平穩,色譜峰信息量豐富。

本研究建立了半枝蓮HPLC指紋圖譜聯合化學計量學的質量分析方法,結果顯示,不同產地半枝蓮指紋圖譜相似度均大于0.900,相對峰面積有差異,表明不同產地半枝蓮所含的化學成分種類一致性高,但化學成分含量有差異。K-means和Ward聚類分析、PCA和PLS-DA均顯示不同產地半枝蓮分3類。質量標志物鑒別顯示各產地半枝蓮化學成分的含量有差異,能分辨各產地半枝蓮質量的優劣和穩定性,可作為半枝蓮質量標志物的考察指標。分析原因,可能與不同產區的氣候、緯度、海拔、土壤和藥材采收原則等有關[18-20],有待進一步研究。

半枝蓮HPLC指紋圖譜加化學計量學的質量評價方法能全面反映不同產地半枝蓮的化學成分信息,為半枝蓮飲片的質量標準研究和含半枝蓮的中成藥質量標準研究提供依據。