正己烷與氯化鈣介導法聯產提取未破壁螺旋藻的藻藍蛋白和油脂

郭旭,魏登梟,鐘彩榮,蘭英,何勇錦,2,陳必鏈,2*

1(福建師范大學 生命科學學院,福建 福州,350117)2(工業微生物教育部工程研究中心(福建師范大學),福建 福州,350117)

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)具有極高的營養價值,含有藻藍蛋白、必需脂肪酸(如亞油酸、γ-亞麻酸)等多種高附加值活性物質,已被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等領域。MA等[1]研究表明,藻藍蛋白具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、降血脂和降血糖、抗血栓、抗病毒、調節腸道微生物群特性等多重功效。同時,食用亞油酸和γ-亞麻酸可降低機體的膽固醇與血脂,具有促進嬰幼兒認知、延緩皮膚衰老等生物學功能[2]。因此,利用螺旋藻開發藻藍蛋白、必需脂肪酸等高附加值制品是螺旋藻深加工研究領域的熱點。

YU[3]利用螺旋藻提取藻藍蛋白的方法有浸泡法、反復凍融法、珠磨法、高壓均質法、超聲波破碎法、溶菌酶法等。HADIYANTO等[4]采用響應面法優化超聲波輔助提取螺旋藻藻藍蛋白,在溫度52.5 ℃、提取時間42 min、超聲波頻率42 kHz條件下,獲得藻藍蛋白最佳得率為15.7%。KFERB?CK等[5]運用脈沖電場和反復凍融組合技術成功提取了螺旋藻中的藻藍蛋白,并獲得了高純度的產品。與傳統的珠磨法相比,該方法將藻藍蛋白的提取率提高了90%。對于提取螺旋藻油脂,RIZWANUL等[6]也研發了有機溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流萃取等方法。DE SOUSA等[7]使用水作為溶劑,利用微波輔助技術在620 W下連續提取3次,每次持續20 s,獲得大約35%的螺旋藻油脂產率。基于現有文獻資料,對于螺旋藻這類生物質資源,研究者的提取方法僅提取螺旋藻中的藻藍蛋白或油脂。這無疑會導致螺旋藻另一種高附加值成份的浪費。為此,亟需研發一種低碳經濟的提取方法,實現螺旋藻藻藍蛋白和油脂的聯產提取,解決現有螺旋藻藻藍蛋白與油脂提取的技術瓶頸。

眾所周知,藻藍蛋白和油脂屬于螺旋藻胞內產物。對于給定的某一提取方法,堅韌的螺旋藻細胞壁會影響其提取性能[8]。已有研究指出,通過物理、化學或生物法破壁螺旋藻,可顯著提高提取性能[5]。但是,對于規模化應用上,前處理破壁工藝無疑會增加其提取成本[9]。因此,本研究以未破壁的螺旋藻為原料,選擇食品級正己烷為有機溶劑,在室溫條件下,研發正己烷和鹽介導的提取法聯產提取藻藍蛋白和油脂。同時研究鹽類種類、正己烷-鹽類濃度、料液比等工藝參數對聯產提取藻藍蛋白和油脂性能的影響,優化工藝參數,以獲得最高的提取性能,為工業化聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)藻粉,福清市新大澤螺旋藻有限公司。螺旋藻藻粉的總蛋白質含量為54.12%,藻藍蛋白含量為9.91%,糖類化合物含量為18.79%,總油脂含量為13.10%。

CaCl2、NaCl、KCl、NH4Cl、MgCl2(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司;CH3COONa、CH3COOK、(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、檸檬酸鈉、檸檬酸銨、KH2PO4、K2HPO4、正己烷(均為分析純),西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器設備

SHA-B雙功能水浴搖床,江蘇中和實驗儀器制造有限公司;RE-52A旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-DⅢ循環水真空泵,鞏義市予華儀器有限責任公司;SCION-436氣相色譜儀,天美儀拓實驗室設備(上海)有限公司;K9840全自動凱氏定氮儀,濟南海能儀器股份有限公司;BS224S電子秤,北京賽多利斯系統儀器有限公司;H11650-W湘儀離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;BX-51熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司。

1.3 正己烷-鹽介導法聯產提取未破壁的鈍頂螺旋藻藻藍蛋白和油脂

1.3.1 鹽類篩選

稱取0.5 g鈍頂螺旋藻藻粉放入50 mL離心管中,按照料液比1∶40(g∶mL)加入20 mL 50 g/L的CaCl2,再加入20 mL正己烷,在室溫條件下恒定轉速下反應3 h。然后,將混合體系2 000 r/min離心10 min,以促進相分離。取上層正己烷相,在真空條件下旋轉蒸發正己烷,得到鈍頂螺旋藻粗油脂。取下層含有藻藍蛋白的水相,測定可溶性的螺旋藻藻藍蛋白。評估不同鹽類對聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂提取率的影響,篩選獲得最適合的鹽類。

1.3.2 優化工藝參數

在所得最適合的鹽類條件下,以藻藍蛋白和油脂的提取率為指標,優化正己烷-鹽介導法聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂的工藝參數(鹽濃度、正己烷與懸浮液的體積比、料液比和提取時間),獲得鈍頂螺旋藻胞內生物活性成分的最佳提取率。

1.4 測定方法

1.4.1 鈍頂螺旋藻藻粉基本成分的測定

采用SN/T 1113—2002 《進出口螺旋藻粉中藻藍蛋白、葉綠素含量的測定方法》測定鈍頂螺旋藻藻粉中總藻藍蛋白的含量;采用氯仿-甲醇法測定鈍頂螺旋藻藻粉總油脂含量[10];采用硫酸-苯酚法測定鈍頂螺旋藻藻粉中總糖含量[11];采用GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定》中凱氏定氮法,測定鈍頂螺旋藻藻粉中總蛋白質含量;通過氣相色譜儀分析鈍頂螺旋藻粗油脂的脂肪酸組成成分。

1.4.2 藻藍蛋白和油脂提取率的測定

取體系下層水相樣品,使用紫外可見分光光度計分別在652和620 nm下測定吸光值,藻藍蛋白的質量濃度和提取率按公式(1)、公式(2)計算[12-13]:

(1)

(2)

式中:V1,水相的體積,mL;m1,鈍頂螺旋藻內藻藍蛋白的質量,g。

取上層正己烷相在旋轉蒸發儀上進行旋蒸,將正己烷完全除去之后得到油脂,對獲得的油脂進行稱重,其提取率的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:m2,提取得到的鈍頂螺旋藻內油脂的質量,g;m3,鈍頂螺旋藻的總油脂質量,g。

1.4.3 螺旋藻油脂肪酸組成分析

提取的螺旋藻藻油經甲酯化后通過氣相色譜儀測定脂肪酸組成。氣相色譜條件[14]:色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣He;升溫程序為100 ℃保持1 min,以40 ℃/min升溫至210 ℃,接著以20 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min;檢測器溫度260 ℃;注射口溫度250 ℃;分流比1∶40;進樣量1 μL。

1.5 數據分析

每個實驗均重復3次,數據處理使用Excel軟件,圖表繪制采用Origin Pro 8.5軟件,所有數據以平均值±標準差的形式呈現。差異顯著性分析采用SPSS 27.0統計軟件,P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同鹽類對聯產提取未破壁螺旋藻藻藍蛋白和油脂提取性能的影響

在室溫條件下,以未破壁鈍頂螺旋藻為原料,選擇食品級正己烷為有機溶劑,研究不同鹽類對聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂性能的影響,結果如表1所示。在所選擇的鹽類中,由正己烷和CaCl2介導的提取法表現出最高的螺旋藻藻藍蛋白和油脂的提取率,即62.47%和12.59%。LAUCERI等[15]也發現CaCl2可顯著提高藻藍蛋白的提取率。CaCl2具有較高的滲透活性,可以破壞細胞壁的結構,提高細胞膜的通透性[16-17],有利于胞內藻藍蛋白油脂的釋放。因此,根據表1的結果,選擇正己烷-CaCl2介導的提取體系,進一步優化其聯產提取未破壁螺旋藻藻藍蛋白和油脂的工藝參數。

表1 不同鹽類聯產提取未破壁螺旋藻藻藍蛋白和油脂提取性能的影響Table 1 Effect of different salts on the extraction performance of phycocyanin and lipids from S. platensis using salt/n-hexane co-extraction

2.2 不同CaCl2質量濃度對螺旋藻活性物質聯產提取性能的影響

從圖1可知,當提取體系的CaCl2質量濃度從0提高到30 g/L,螺旋藻藻藍蛋白的提取率從32.23%提高到62.48%。但是,當繼續提高提取體系的CaCl2濃度時,藻藍蛋白提取率明顯呈現下降趨勢。這是因為過高的CaCl2濃度可能使藻藍蛋白發生鹽析沉淀[18],導致其提取率下降。此外,圖1還表明,鈍頂螺旋藻油脂的提取率隨著CaCl2濃度的增加呈現先上升后趨于平穩的趨勢。在CaCl2質量濃度為30～70 g/L時,正己烷-CaCl2介導法提取螺旋藻油脂的提取率則無顯著差異。因此,最佳提取螺旋藻油脂的CaCl2濃度為30～70 g/L。基于圖1的實驗結果,選擇30 g/L CaCl2質量濃度作為正己烷-CaCl2介導法聯產提取藻藍蛋白和油脂。

圖1 CaCl2濃度對提取性能的影響Fig.1 Influence of CaCl2 content on the extraction performance

2.3 正己烷與懸浮液的體積比對提取性能的影響

由圖2可知,隨著正己烷用量的增加,正己烷-CaCl2介導法提取螺旋藻藻藍蛋白的提取率無明顯變化(66.26%～68.77%)。這可能是因為,正己烷作為非極性有機溶劑,主要用于溶解中性油脂[19],不會對水相中的藻藍蛋白產生影響。當正己烷與懸浮液體積比從0.5∶1提高到2∶1時,正己烷-CaCl2介導法提取螺旋藻油脂的提取率從8.35%提高到24.73%(圖2);而繼續提高提取體系中正己烷的用量(2.5∶1),螺旋藻油脂的提取率無顯著變化。因此,選擇2∶1作為正己烷與懸浮液的最佳體積比。

圖2 正己烷與懸浮液的體積比對提取性能的影響Fig.2 Influence of ratio of n-hexane to suspension on the extraction performance

2.4 料液比對提取性能的影響

由圖3可知,當料液比從1∶10降低到1∶60時,正己烷-CaCl2介導法提取未破壁螺旋藻藻藍蛋白的提取率從52.19%提高到68.97%,這是因為隨著液料比的增加,生物質分子與溶質分子的接觸得到了更充分的保證。同時,增加提取液用量還可以提高溶劑分子在細胞中的擴散速率,進一步促進了藻藍蛋白的有效提取[17]。繼續增加提取液用量(1∶80),藻藍蛋白的提取率呈下降趨勢,這可能是在本研究中,固定提取體系的藻粉量后,隨著提取溶液量的增加,提取體系中的CaCl2濃度也隨之增加,引起提取的藻藍蛋白產生部分鹽析[18],降低了藻藍蛋白提取率。這些結果與余佳等[20]從葛仙米中提取藻膽蛋白的單因素實驗研究結果相吻合。另外,鈍頂螺旋藻油脂的提取率隨著提取液用量的增加而持續增加,當料液比從1∶10降低到1∶60時,油脂提取率從13.82%提高到22.83%;繼續增加提取液用量(1∶80),油脂的提取率無顯著變化。基于圖3的實驗結果,選擇1∶60作為正己烷-CaCl2介導法聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂的最佳料液比。

圖3 料液比對提取性能的影響Fig.3 Influence of material-to-liquid ratios on the extraction performance

2.5 提取時間對提取性能的影響

提取時間的長短是評判提取方法是否可進行規模化應用的重要參數。由圖4可知,當提取時間從1 h增加到3 h時,正己烷-CaCl2介導法提取未破壁螺旋藻藻藍蛋白的提取率顯著增加,從61.73%提高71.03%;隨后,提取時間的繼續延長導致藻藍蛋白的提取率呈現下降趨勢。這可能是因為,加入30 g/L CaCl2時,隨著提取時間的延長,CaCl2鹽類與提取的藻藍蛋白會持續相互作用,導致水相中的藻藍蛋白發生鹽析沉淀,降低水相的藻藍蛋白的濃度。此外,當提取時間從1 h提高到3 h時,正己烷-CaCl2介導法提取螺旋藻油脂的提取率從15.49%提高到26.19%(圖4),繼續延長提取時間,螺旋藻油脂的提取率無顯著變化。

關于油脂的提取率不同于藻藍蛋白提取率的變化情況,主要是因為:(1)藻藍蛋白和油脂是2種結構不同的生物活性物質;(2)在所研發的正己烷-CaCl2提取體系中,提取所得的藻藍蛋白和油脂分別分布在提取體系的水相和有機相中;(3)CaCl2鹽類不會溶解于正己烷,因此不會干擾有機相中油脂的沉淀或分布。綜上,正己烷-CaCl2介導法最佳聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂的提取時間為3 h。

目前,科技工作者已研發了多種用于提取螺旋藻藻藍蛋白或油脂的提取方法,如反復凍融法、高速勻漿法、高壓乙醇提取法、超臨界CO2提取法等(表2)。

表2 不同提取方法提取螺旋藻生物活性物質的比較Table 2 Comparison of extraction methods for bioactive substances from Spirulina biomass

與傳統反復凍融法相比,本研究的正己烷和CaCl2介導提取法可更有效地提取螺旋藻藻藍蛋白,但油脂提取率僅為26.19%,低于PINTO等[21]和YANG等[22]的結果。這可能是因為本研究所選擇的有機溶劑為正己烷。今后將進一步研發更有效的提取方法,實現高效地聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂。值得注意的是,本研究所研發的正己烷和CaCl2介導提取法,不僅可聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂,而且經提取后還可以實現藻藍蛋白和油脂的分離,對規模化應用具有重要的意義。

2.6 正己烷與CaCl2介導法提取前后細胞破碎對比

提取前的螺旋藻呈現彎月的形狀(圖5-a),大小約為40 μm。在最優的提取條件下,采用正己烷-CaCl2介導的一步法聯產提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂,并對藻細胞進行顯微觀察,發現提取后的藻細胞呈現不規則的細胞碎片(圖5-b),大小約為6 μm。由此可見,正己烷CaCl2介導法所使用的CaCl2和正己烷作為提取介質可有效地使螺旋藻細胞發生破壁作用,進而使胞內的藻藍蛋白和油脂分別溶解在水溶液和正己烷中,達到提取和分離的效果。

2.7 提取所得螺旋藻油脂的脂肪酸組成

如表3所示,鈍頂螺旋藻藻粉原料的主要脂肪酸是棕櫚酸(40.34%)、亞油酸(16.10%)和γ-亞麻酸(21.72%)。YANG等[22]發現,螺旋藻主要脂肪酸含有45.82%的棕櫚酸、21.99%的亞油酸和23.99%的γ-亞麻酸略高于本研究結果;而OLIVEIRA等[27]研究表明,螺旋藻干粉中含有32.53%的棕櫚酸、13.86%的亞油酸和20.56%的γ-亞麻酸略低于本研究結果。值得注意的是,正己烷CaCl2介導法提取所得的螺旋藻油脂的棕櫚酸含量低于原料的值;但是,亞油酸和γ-亞麻酸含量確高于原料的值(表3)。這有可能是,鈍頂螺旋藻所合成的亞油酸和γ-亞麻酸主要分布在中性脂中[28]。本研究中,使用的正己烷屬于食品級,經蒸餾后收集的正己烷可進行回收,去除正己烷所得的螺旋藻油脂可開發成高附加值的藻油制品,應用于食品、醫藥等領域。

3 結論

本文率先研發了一種正己烷和CaCl2介導的一步提取法,在室溫條件下,可聯產提取未破壁螺旋藻中的藻藍蛋白和富含多不飽和脂肪酸的油脂,并優化其提取工藝。最佳聯產提取未破壁螺旋藻藻藍蛋白和油脂的工藝條件為CaCl2濃度為3%,正己烷和懸浮液的體積比為2∶1,料液比為1∶60,提取時間3 h。在最優的提取工藝條件下,藻藍蛋白和油脂的最高提取率分別為71.06%和26.19%。正己烷-CaCl2介導的一步提取法可最大程度上聯產提取未破壁螺旋藻的藻藍蛋白和油脂,并達到藻藍蛋白和油脂的分離,實現螺旋藻生物質的綜合利用。研究結果可推動螺旋藻提取藻藍蛋白和/或油脂的發展,為我國螺旋藻深加工技術提供理論依據。雖然本研究所得的油脂提取率較低,今后將研發更高效的提取螺旋藻油脂的方法,最終達到一步聯產低碳高效提取螺旋藻藻藍蛋白和油脂的目的,突破現有螺旋藻深加工技術的技術瓶頸。