姜黃素納米粒構建及體外細胞攝取

楊 丹，袁 穎，姚曉琳,*，秦 丹，劉德春

（1.陜西科技大學食品科學與工程學院，生物與醫藥學院，陜西 西安 710021；2.西北工業大學醫學研究院，陜西 西安 710072）

姜黃隸屬于姜科、姜黃屬，是一種藥食同源植物[1]。姜黃素（curcumin，Cur）存在于姜黃根莖中，含有特殊的二酮類結構，作為天然的食品添加劑、著色劑被廣泛使用[2]。Cur雖然具有抗腫瘤、抗炎癥、降血糖、抗氧化、抗凋亡等多種生理活性[3-4]，但其在光照和高溫條件下會降解[5]，不易存儲與運輸，同時由于其親脂性強、水溶性差，因此口服生物利用度也較低[6]。在食品領域的研究中，會將姜黃素等對外界環境敏感的活性物質負載在食品運載體系中，以改善活性物質的水溶性，增加其對光和熱的穩定性，調節活性物質的釋放行為，進而提高它們的功效[7]。

納米遞送系統指用納米級載體（粒徑在10～1000 nm之間）包埋活性物質，提高活性物質的功能特性，從而改善活性物質的遞送效率的系統[8]。納米載體比表面積大，活性物質負載率高、穩定性強[9]、毒性低[10]，在食品領域應用廣泛。研究發現，與游離Cur相比，納米載體包埋的Cur的水溶性[11]、胃腸道穩定性[12]、紫外穩定性[13]及抗氧化活性[14]均得到了顯著提高。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）生物相容性好，刺激性及毒副作用小，是目前應用最為廣泛的納米材料之一[15-16]。PLGA納米粒（PLGA-nanoparticle，PLGA-NP）在降解時表面逐漸產生微孔，使包埋物逐漸暴露于納米粒表面并緩慢釋放，從而達到緩釋的效果[17-18]。在口服遞送納米粒時，黏液層、腸上皮細胞層等多個屏障的存在會影響腸細胞對納米粒的吸收，進而影響腸細胞對活性物質的吸收[19]。主動靶向納米載體在納米載體表面修飾可與細胞表面的受體特異性結合的配體，可增加納米載體在細胞表面的吸附量，從而提高納米載體的吸收量[20]。研究表明轉鐵蛋白受體（TfR）、整合素受體（αVβ3/5）、新生兒Fc受體（FcRn）、葉酸受體（FAR）等皆可作為主動靶向納米載體的作用靶點[21]，其中人轉鐵蛋白（transferrin，Tf）是參與鐵吸收和細胞生長的必需蛋白，除了成熟的紅細胞外，TfR存在于幾乎所有細胞表面，Tf的修飾可提高納米粒在腸細胞的穿透能力，進而提高活性物質的吸收效率。

基于以上研究背景，本實驗將PLGA作為納米載體材料對Cur進行包埋，以Cur負載率為指標，通過單因素篩選法對包埋Cur的PLGA-NP（Cur-PLGA-NP）的配方工藝進行優化。用Tf對PLGA-NP進行修飾，同時用與人血清白蛋白高度近似[22]，安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好[23]的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為Tf的陰性對照，以消除蛋白修飾的影響。以TfR高表達的結腸癌細胞系HT-29細胞[24]為細胞模型，對Tf修飾的主動靶向納米粒（Tf-NP）及BSA修飾的納米粒（BSA-NP）的細胞攝取進行評價，研究Tf-NP提高細胞對納米粒攝取的效果，從而為增加腸細胞對Cur吸收的運載體系的設計提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cur 上海易恩化學技術有限公司；PLGA 濟南岱罡生工程有限公司；乙腈 天津市科密歐化學試劑有限公司；泊洛沙姆F68（Poloxamer F68）巴斯夫股份公司；BSA 北京索萊寶科技有限公司；Tf 上海西格瑪生物有限公司；香豆素6（coumarin 6，C6）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRITC Phalloidin 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Hoechst33342 北京雷根生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GL124-1SCN型分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；KQ-300DE型數控超聲清洗器 昆山市超聲儀器公司；H1650R型高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；XH-C型渦旋混合器常州越新儀器制造有限公司；Litesizer 500型動態光散射（dynamic light scattering，DLS）儀 奧地利安東帕有限公司；Mini-P4型電泳槽、JY600C型電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；LSM800型激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）卡爾蔡司光學有限公司；潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PLGA-NP及Cur-PLGA-NP的制備

稱取一定量的F68溶于去離子水中，得其水溶液，備用；稱取一定量的PLGA、Cur分別溶于乙腈中，得其儲備液，備用。

溶劑揮發法：在室溫磁力攪拌狀態下取一定量Cur和PLGA乙腈溶液緩慢勻速滴加至F68水溶液中，滴加完畢后可調節溫度至40 ℃，待有機溶劑完全揮發后，1000 r/min、10 m i n 離心2 次以去除未包封的C u r，上層溶液12000 r/min、10 min離心洗滌3 次以去除多余的F68，收集下層納米粒即得Cur-PLGA-NP。

薄膜分散法：取一定量Cur和PLGA乙腈溶液于25 mL茄形瓶中，40 ℃、1100 r/min旋蒸至瓶內液體成膜，加入一定量同溫度的去離子水，渦旋振蕩至薄膜脫落，水浴超聲分散，1000 r/min、10 min離心2 次以去除未包封的Cur，上層溶液12000 r/min、10 min離心洗滌3 次以去除多余的F68，收集下層納米粒即得Cur-PLGA-NP。

1.3.2 單因素法篩選制備方法及配方

以制備方法（溶劑揮發法和薄膜分散法），兩相混合方式（水相加入有機相中和有機相加入水相中），有機相與水相體積比（1∶1.25、1∶2.5、1∶5、1∶10）、Cur與PLGA質量比（1∶10、1∶15、1∶20）、PLGA質量濃度（10、20、30、40、50 mg/mL）、乳化劑F68質量分數（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）為單因素，將Cur的負載率作為指標篩選出最優配方工藝。

1.3.3 Cur-PLGA-NP負載率的測定

1.3.3.1 Cur標準曲線的制作

用分析天平精密稱取20 mg Cur，加入乙腈使其充分溶解得到質量濃度為2 mg/mL的Cur溶液，繼續用乙腈稀釋至質量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40 μg/mL，取200 μL至96 孔板中，用酶標儀在420 nm波長處測定各質量濃度Cur溶液的吸光度，根據測得吸光度制作Cur的標準曲線，并進行線性擬合，得到回歸方程。

1.3.3.2 Cur負載率的測定

取凍干后包埋Cur的納米粒質量W1（mg），溶于一定量的乙腈，按照Cur檢測方法計算得出Cur質量W2（mg），根據下式計算負載率：

1.3.4 粒徑分布測量

取1 mL Cur-PLGA-NP溶液于粒徑杯中，用DLS測定和記錄每組樣品的粒徑和多分散性指數（polymer dispersity index，PDI）。

1.3.5 納米粒穩定性考察

將Cur-PLGA-NP避光密封保存于4 ℃冰箱中，分別于第1天和第10天取樣，測定其粒徑和PDI。

1.3.6 Cur-PLGA-NP的Cur體外釋放

精密吸取1 mL Cur-PLGA-NP溶液于經過預處理的透析袋（mw=8000～14000 Da）內，兩端扎緊，并將其置于含有5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，于37 ℃搖床中，100 r/min恒溫振蕩，在設定的時間點自釋放介質中取出250 μL，并立即補入250 μL同溫度的新鮮釋放介質，用酶標儀在420 nm波長處測定Cur吸光度，帶入Cur的標準曲線中即可計算出Cur的釋放量，根據下式計算Cur的累計釋放率：

式中：C1、C2、C3…Cn為第1、2、3…n個時間點Cur的質量濃度/（μg/mL）；V為第1、2、3…n個時間點所取釋放介質的體積/mL；V總為Cur-PLGA-NP溶液和釋放介質的總體積之和/mL；M投為總投藥量/μg。

1.3.7 BSA-NP和Tf-NP的制備

精密移取一定量的C6標記的PLGA-NP（制備方法同Cur-PLGA-NP，將Cur替換為C6），將其分散于2-(N-嗎啉)乙磺酸（0.1 mol/L）緩沖溶液中，加入一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫下磁力攪拌20 min使納米粒的羧基充分活化[25]。活化后再12000 r/min離心10 min，棄去上清液，將下層已活化好的納米粒分散于PBS中，加入一定量的BSA或Tf，室溫下攪拌4 h，12000 r/min、10 min離心洗滌3 次，除去未連接的蛋白，收集下層納米粒，即得所需的BSA或Tf修飾的PLGA-NP（BSA-NP/Tf-NP）。

1.3.8 BSA-NP、Tf-NP的驗證

用SDS-PAGE證實BSA或Tf修飾的納米粒，SDSPAGE具體過程如下：

a）Tirs-甘氨酸電泳緩沖液的配制：用分析天平精密稱取3.02 g Tris、18.8 g甘氨酸、1 g SDS，并將其置于1 L的試劑瓶中，向其中加入800 mL超純水，超聲使其完全溶解，最后用超純水定容至1 L，置于室溫下保存。

b）取BSA-NP、Tf-NP溶液各1 mL，12000 r/min多次離心，棄去上清液，使下層納米粒盡可能殘留少的液體。在BSA-NP、Tf-NP、BSA標準品、Tf標準品中加入5×loading buffer，91 ℃加熱5 min。

c）按表1配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，依次將蛋白標準品10 μL，待測樣品加入到上樣孔中。60 V、20 min，120 V、1 h條件下電泳，直至藍色的泳帶前沿到分離膠底端停止。切去濃縮膠，保留分離膠。將分離膠放入裝有100 mL超純水的表面皿中，在脫色搖床上搖動5 min，再重復洗滌2 次。將超純水洗滌后的分離膠放入裝有30 mL考馬斯亮藍染色液的表面皿中，在脫色搖床上染色60 min。加入50 mL考馬斯亮藍染色脫色液在脫色搖床上搖動，每次30 min，重復此操作至分離膠背景洗去，直至條帶清晰。拍照保存。

表1 10%分離膠、4%濃縮膠的配制Table 1 Preparation of 10% separating and 4% stacking gels

1.3.9 細胞攝取

納米粒用C6進行熒光標記后，進行細胞實驗，對比兩種納米粒的攝取量。

將長滿細胞的25 cm2細胞培養瓶用胰酶消化處理后，取1×105/孔細胞接種于24 孔板中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養，待細胞匯合度達到80%～90%時，棄去培養液，PBS清洗3 次，每孔加入200 μL用不完全培養液重懸的質量濃度為80 ng/mL的BSA-NP或Tf-NP溶液，繼續培養設定時間，攝取結束后，用冰冷的PBS終止攝取并清洗細胞3 次，用胰酶消化處理后，收集細胞懸液1000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集下層細胞加入100 μL細胞裂解液，過夜。加入100 μL乙腈，13000 r/min離心20 min，取100 μL上清液用酶標儀在λex=460 nm、λem=530 nm測量C6熒光強度進行分析。

攝取步驟同上，用冰冷的PBS終止攝取并清洗細胞3 次，TRITC Phalloidin對微絲進行染色，Hoechst33342對細胞核進行染色，使用CLSM進行檢測。

1.4 數據處理

所有實驗均進行3 次重復，采用Excel 2010進行實驗數據統計，采用GraphPad Prism軟件對實驗結果進行分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 Cur-PLGA-NP的制備方法及配方優化

2.1.1 含量測定方法的建立

經計算，得到Cur-乙腈溶液的質量濃度在0.1～40 μg/mL范圍內的線性回歸方程A=0.0644c+0.0559（R2=0.9999），線性關系良好。

2.1.2 Cur-PLGA-NP的制備方法及配方篩選

2.1.2.1 制備方法的篩選

溶劑揮發法根據分散相和連續相的不同，分為單乳法和復乳法。單乳法-溶劑揮發法根據制備過程中的乳液類型分為水包油（O/W）型、油包油（O/O）型乳化-溶劑揮發法[26]。O/W型是將活性成分和載體溶解在有機試劑（如乙腈）中，并將其分散在含有乳化劑的水相中，通過機械攪拌或超聲分散成O/W型乳液，除去內相溶劑后固化成球[27]。薄膜分散法是將脂溶性活性成分溶于有機試劑中，在燒瓶中旋轉蒸發，使其在內壁形成一層薄膜，將水加入到燒瓶中不斷攪拌即得納米粒[28]。溶劑揮發法和薄膜分散法操作簡單，對設備要求不高，適用于實驗室等場所，因此在本研究中選用這兩種方法進行比較。如圖1A所示，不同負載質量比時，溶劑揮發法制備的納米粒負載率均高于薄膜分散法，說明溶劑揮發法優于薄膜分散法。袁佳妮等[29]采用薄膜分散法的負載率為3.9%，單乳化-溶劑揮發法的負載率為6.8%，該研究結果同本實驗結果相似，均為溶劑揮發法的負載率高。如圖1B所示，油相加入至水相制備的納米粒負載率均高于水相加入至油相，說明油相加入至水相中的兩相混合方式更適用于該體系。這可能是由于利用溶劑揮發法，油相與水相的體積比為1∶2.5時制備得到的乳液類型為O/W型，而油相加入至水相分散性更好[30]。

圖1 Cur-PLGA-NP制備方法的篩選Fig.1 Screening of Cur-PLGA-NP preparation methods

2.1.2.2 配方的篩選

研究發現油水相比例、負載質量比、乳化劑質量濃度等會影響納米載體的負載率[31]，因此對這幾種影響因素進行篩選。如圖2A所示，油相和水相體積比為1∶2.5時制備納米粒的Cur負載率均高于其他比例，說明油相和水相的體積比為1∶2.5的制備比例最優。有研究表明，降低油水相體積比能顯著增加納米粒的負載率，減少突釋[32]。因為增大水相的量可達到稀釋有機溶劑的效果，從而使有機溶劑以高質量濃度梯度跨過相界面[33]。曾慶晗等[34]發現當油相體積比較低時，姜黃素納米乳液具有較高的穩定性，因而Cur具有較高的保留率。如圖2B所示，Cur與PLGA質量比為1∶15時制備納米粒的負載率均高于其他比例，說明Cur與PLGA質量比為1∶15的制備比例最優。Zaghloul等[35]發現載體和活性成分的比例對負載率影響較大。提高載體和活性成分的比例，可有效阻止納米粒制備過程中活性成分向水相的泄漏，從而得到較高的負載率，但載體和活性成分的比例需控制在一定范圍內，若活性成分過多則不能完全被載體包埋，從而造成藥物損失，降低包封率[33]。如圖2C所示，PLGA質量濃度為10 mg/mL時制備的納米粒負載率均高于其他質量濃度，這可能是由于PLGA質量濃度大于10 mg/mL，溶劑揮發法滴加油相時局部的PLGA質量濃度過大，導致體系不穩定，容易析出[36]。F68是一類高分子非離子型表面活性劑，作為乳化劑降低了混合體系中各組分的表面張力，并在微滴表面形成較堅固的薄膜或由于乳化劑給出的電荷而在微滴表面形成雙電層，阻止微滴彼此聚集，而保持均勻的乳狀液[37]。如圖2D所示，F68質量分數在0.1%～0.5%范圍內時各組Cur的負載率差距不大，而質量分數為0.3%時樣品的重復性較好。另外，F68的質量分數越大細胞毒性越大[38]，因此選擇0.3%作為F68的使用質量分數。

圖2 Cur-PLGA-NP制備配方的篩選Fig.2 Optimization of the formulation of Cur-PLGA-NP

綜上所述，Cur-PLGA-NP的最優配方為油水體積比為1∶2.5，Cur與PLGA質量比為1∶15，PLGA質量濃度為10 mg/mL，乳化劑F68質量分數為0.3%；制備方法如圖3所示，通過溶劑揮發法及油相加入至水相中的兩相混合方式制備納米粒。

圖3 包埋Cur及蛋白修飾的納米粒制備示意圖Fig.3 Schematic preparation of Cur-loaded and protein-modified nanoparticles

2.2 納米粒的表征

2.2.1 包埋Cur納米粒的表征

如表2所示，PLGA-NP的粒徑在101 nm左右，Cur-PLGA-NP粒徑稍有增加，約為103 nm，納米粒的PDI均小于0.2，分散性較好。Cur-PLGA-NP的負載率約為5.58%，相對于Cur在水中的溶解度（11 μg/L）[39]，PLGA-NP的包載提高了Cur在水中的溶解性。

表2 納米粒的負載率、粒徑Table 2 Loading rates and particle sizes of nanoparticles

如圖4A所示，PLGA-NP具有淡藍色乳光，顯示出明顯的膠體特征。Cur-PLGA-NP呈黃色，均勻分散在水中。納米載體穩定性對于活性物質的存儲、運輸及機體吸收利用極其重要，而粒徑及PDI是評判納米載體穩定性的有效方法[40]。對各納米粒的穩定性進行考察，結果顯示PLGA-NP、Cur-PLGA-NP粒徑、PDI在10 d內沒有顯著變化（圖4B），說明PLGA-NP、Cur-PLGA-NP在4 ℃條件下10 d內穩定性良好。當活性物質被載體材料包埋時，其溶解度與穩定性可被提高，加上緩釋作用，可達到更好的治療效果[41]。為確定Cur-PLGA-NP的釋放效果，以Cur溶液和Cur粗品作為對照，如圖4C所示，隨著時間的延長，Cur溶液、Cur粗品和Cur-PLGA-NP在模擬腸液中的溶出度逐漸增加。其中，由于Cur溶液中的Cur為分子狀態，在1 d之內基本釋放完全；而Cur粗品中有Cur結晶，故釋放效果極差；Cur-PLGA-NP中的Cur經過納米粒包埋后不僅提高了其在腸液中的溶出度并且具有一定的緩釋效果。Su Ya等[42]研究發現Cur經過蓮子蛋白質包埋后在腸道亦具有緩釋效果，與本實驗結果相似。

圖4 納米粒的表征Fig.4 Characterization of Cur-loaded nanoparticles

2.2.2 蛋白修飾后納米粒的表征

SDS-PAGE有濃縮膠和分離膠的不連續系統，樣品可以在進入分離膠之前先在濃縮膠上達到相同的初速度和初始值[43]，目前主要用于蛋白質的純度分析、蛋白質分子質量測定、蛋白質質量濃度測定、蛋白質修飾鑒定等方面[44]。蛋白修飾納米粒的制備方法如圖3所示，為驗證BSA及Tf在納米粒表面的修飾效果，利用SDSPAGE對修飾后的納米粒進行檢測。如圖5A所示，BSANP和Tf-NP中皆檢測到相對應的BSA和Tf條帶，說明蛋白已成功修飾于納米粒表面。粒徑大小會影響腸細胞對納米粒的攝取量，崔亞男等[45]發現在相同的給藥質量濃度下，小粒徑納米粒入胞速率快于較大粒徑的納米粒，因此探究了BSA及Tf修飾對納米粒粒徑所帶來的影響。如圖5B所示，相對于PLGA-NP約為101 nm的粒徑（表2），蛋白的修飾使納米粒粒徑明顯增加。BSA-NP粒徑為（152±3.23）nm，Tf-NP粒徑為（159±6.91）nm，兩種納米粒粒徑大小及分布相差不大，這在一定程度上排除實驗過程中粒徑大小帶來的干擾。

圖5 蛋白修飾后納米粒的表征Fig.5 Characterization of protein-modified nanoparticles

2.3 細胞攝取分析

C6是一種常用的疏水性熒光物質，在合適的激光條件下可檢測到熒光信號，檢測限低、靈敏度高，常作為疏水性活性物質的模型包載于運載體系中，用于納米載體的標記[46]。為驗證納米粒的質量濃度與細胞攝取量的關系，選擇不同質量濃度的納米粒分別與細胞共孵育。如圖6A所示，HT-29細胞對兩種納米粒的攝取量均隨著納米粒質量濃度的增加而增加，說明細胞攝取量與納米粒質量濃度呈正相關。文星星等[47]制備的殼聚糖修飾的PLGA-NP細胞攝取時呈現質量濃度依賴性，也得到與本實驗相似的結果。為驗證Tf的修飾是否可提高腸細胞對納米粒的攝取量，以BSA-NP作為陰性對照，對Tf-NP及BSA-NP的細胞攝取進行對比，結果顯示Tf-NP組的胞內C6熒光強度顯著高于BSA-NP組（圖6B），說明Tf-NP組的攝取顯著高于BSA-NP組，表明Tf的修飾可以提高HT-29細胞對納米粒的攝取量。Wiley等[48]發現高的Tf修飾密度提高了納米載體與血腦屏障上皮細胞表面受體的親和力，增加了納米載體的入胞量。Yang Dan等[49]發現與BSA修飾的金納米粒相比，Tf修飾的金納米在Caco-2細胞中的攝取量更高，大鼠腸道穿透力更強，口服生物利用度更高。這些結果表明Tf的修飾可提高腸細胞對納米粒的攝取，進而提高活性物質（例如Cur）的吸收。

圖6 細胞攝取分析Fig.6 Cell uptake of Cur-loaded nanoparticles

如圖7所示，與未加入納米粒的對照組相比，納米粒組的細胞核、微絲皆無明顯變化，說明納米粒對細胞活性的影響較小，即納米粒與細胞的生物相容性較好。納米粒的熒光主要分布在細胞核和微絲之間，說明納米粒已進入到細胞內且大部分處于細胞質中，與文星星等[47]在倒置熒光顯微鏡下觀察到制備的殼聚糖修飾的PLGANP多分布在核周圍的結果相似；與BSA-NP組相比，Tf-NP組熒光強度強于BSA-NP組，說明Tf-NP組攝取量比BSA-NP組多，這與圖6B的細胞攝取結果一致，表明主動靶向納米粒有助于Cur的吸收。

圖7 納米粒與HT-29細胞共孵育12 h后的CLSM圖Fig.7 CLSM of Cur-loaded nanoparticles after 12 h incubation with HT-29 cells

3 結論

Cur在水中極低的溶解度大大限制了它的應用，通過單因素法篩選得到了負載率高、穩定性好的包埋姜黃素的PLGA-NP，該體系有效地改善了Cur的水溶性，可使Cur在模擬腸液中完全釋放，同時具有良好的緩釋效果。通過利用Tf對納米粒表面進行修飾進一步提高了腸細胞對納米粒的攝取率。綜上所述，Tf修飾PLGA-NP可提高Cur的負載率及吸收效率，這為水溶性差的活性物質運載體系設計提供參考。